Alzheimerovoj bolesti (AD) nedostaju proteinski biomarkeri koji odražavaju višestruku temeljnu patofiziologiju, ometajući napredak dijagnoze i liječenja. Ovdje koristimo sveobuhvatnu proteomiku za identifikaciju biomarkera cerebrospinalne tekućine (CSF) koji predstavljaju širok raspon patofiziologije AD. Multipleksna masena spektrometrija identificirala je približno 3500 odnosno približno 12000 proteina u AD CSF i mozgu. Mrežna analiza proteoma mozga razriješila je 44 modula bioraznolikosti, od kojih se 15 preklapa s proteomom cerebrospinalne tekućine. CSF AD markeri u ovim modulima koji se preklapaju složeni su u pet proteinskih skupina, koje predstavljaju različite patofiziološke procese. Sinapse i metaboliti u AD mozgu se smanjuju, ali CSF raste, dok se mijelinizacija bogata glijom i imunološke skupine u mozgu i CSF povećavaju. Dosljednost i specifičnost bolesti panela promjena potvrđeni su u više od 500 dodatnih uzoraka likvora. Ove su skupine također identificirale biološke podskupine u asimptomatskoj AD. Sve u svemu, ovi su rezultati obećavajući korak prema internetskim alatima za biomarkere za kliničku primjenu u AD-u.
Alzheimerova bolest (AD) je najčešći uzrok neurodegenerativne demencije u cijelom svijetu i karakterizirana je širokim rasponom disfunkcija bioloških sustava, uključujući sinaptički prijenos, imunitet posredovan glijom i metabolizam mitohondrija (1-3). Međutim, njegovi utvrđeni proteinski biomarkeri i dalje su usmjereni na otkrivanje amiloida i tau proteina, te stoga ne mogu odražavati ovu raznoliku patofiziologiju. Ovi biomarkeri "core" proteina koji se najpouzdanije mjere u cerebrospinalnoj tekućini (CSF) uključuju (i) amiloidni beta peptid 1-42 (Aβ1-42), koji odražava stvaranje kortikalnih amiloidnih plakova; (ii) ukupni tau, znak degeneracije aksona; (iii) fosfo-tau (p-tau), predstavnik patološke tau hiperfosforilacije (4-7). Iako su ti biomarkeri cerebrospinalne tekućine uvelike olakšali naše otkrivanje "označenih" AD proteinskih bolesti (4-7), oni predstavljaju samo mali dio složene biologije koja stoji iza bolesti.
Nedostatak patofiziološke raznolikosti biomarkera AD doveo je do mnogih izazova, uključujući (i) nemogućnost identificiranja i kvantificiranja biološke heterogenosti bolesnika s AD-om, (ii) nedostatno mjerenje težine i progresije bolesti, posebno u pretkliničkoj fazi, i ( iii) razvoj terapijskih lijekova koji nisu uspjeli u potpunosti riješiti sve aspekte neurološkog pogoršanja. Naše oslanjanje na značajnu patologiju da bismo opisali AD iz povezanih bolesti samo pogoršava ove probleme. Sve više dokaza pokazuje da većina starijih osoba s demencijom ima više od jedne patološke karakteristike kognitivnog pada (8). Čak 90% ili više osoba s AD patologijom također ima vaskularnu bolest, inkluzije TDP-43 ili druge degenerativne bolesti (9). Ovi visoki udjeli patološkog preklapanja poremetili su naš trenutni dijagnostički okvir za demenciju, pa je potrebna sveobuhvatnija patofiziološka definicija bolesti.
S obzirom na hitnu potrebu za raznim AD biomarkerima, polje sve više usvaja metodu "omics" koja se temelji na cjelokupnom sustavu za otkrivanje biomarkera. Accelerated Pharmaceutical Partnership (AMP)-AD Alliance pokrenut je 2014. i prednjači u programu. Ovaj multidisciplinarni napor Nacionalnog instituta za zdravlje, akademske zajednice i industrije ima za cilj korištenje strategija temeljenih na sustavu za bolje definiranje patofiziologije AD i razvoj dijagnostičke analize bioraznolikosti i strategija liječenja (10). Kao dio ovog projekta, mrežna proteomika postala je obećavajući alat za unapređenje sistemskih biomarkera u AD-u. Ovaj nepristrani pristup vođen podacima organizira složene skupove podataka o proteomici u skupine ili "module" koeksprimiranih proteina koji su povezani s određenim vrstama stanica, organelama i biološkim funkcijama (11-13). Gotovo 12 mrežnih proteomičkih studija bogatih informacijama provedeno je na AD mozgu (13-23). Sve u svemu, ove analize pokazuju da proteom moždane mreže AD održava visoko očuvanu modularnu organizaciju u neovisnim skupinama i višestrukim kortikalnim regijama. Osim toga, neki od ovih modula pokazuju ponovljive promjene u obilju povezanih s AD-om u skupovima podataka, odražavajući patofiziologiju višestrukih bolesti. Zajedno, ovi nalazi pokazuju obećavajuću sidrišnu točku za otkriće proteoma moždane mreže kao biomarkera koji se temelji na sustavu u AD-u.
Kako bismo transformirali proteom moždane mreže AD u klinički korisne biomarkere temeljene na sustavu, kombinirali smo mrežu izvedenu iz mozga s proteomskom analizom AD CSF. Ovaj integrirani pristup doveo je do identifikacije pet obećavajućih skupova biomarkera likvora koji su povezani sa širokim rasponom patofiziologije koja se temelji na mozgu, uključujući sinapse, krvne žile, mijelinizaciju, upalu i disfunkciju metaboličkih putova. Uspješno smo potvrdili ove panele biomarkera kroz višestruke replikacijske analize, uključujući više od 500 uzoraka likvora iz različitih neurodegenerativnih bolesti. Ove validacijske analize uključuju ispitivanje grupnih ciljeva u likvoru pacijenata s asimptomatskom AD (AsymAD) ili prikazivanje dokaza abnormalnog nakupljanja amiloida u normalnom kognitivnom okruženju. Ove analize naglašavaju značajnu biološku heterogenost u populaciji AsymAD i identificiraju panel markere koji bi mogli podtipizirati pojedince u najranijim stadijima bolesti. Sve u svemu, ovi rezultati predstavljaju ključni korak u razvoju alata za proteinske biomarkere koji se temelje na višestrukim sustavima koji mogu uspješno riješiti mnoge kliničke izazove s kojima se suočava AD.
Glavna svrha ove studije je identificirati nove biomarkere cerebrospinalne tekućine koji odražavaju različite patofiziologije mozga koje dovode do AD. Slika S1 prikazuje našu metodologiju istraživanja, koja uključuje (i) sveobuhvatnu analizu vođenu preliminarnim nalazima AD CSF-a i mrežnog moždanog proteoma za identifikaciju višestrukih biomarkera bolesti CSF-a povezanih s mozgom, i (ii) naknadnu replikaciju Ovi biomarkeri nalaze se u nekoliko neovisnih cerebrospinalnih fluidne kohorte. Istraživanje usmjereno na otkriće započelo je analizom diferencijalne ekspresije CSF-a u 20 kognitivno normalnih osoba i 20 pacijenata s AD-om u Centru za istraživanje Alzheimerove bolesti Emory Goizueta (ADRC). Dijagnoza AD definira se kao značajno kognitivno oštećenje uz prisutnost niskog Aβ1-42 i povišenih razina ukupnog tau i p-tau u cerebrospinalnoj tekućini [Mean Montreal Cognitive Assessment (MoCA), 13,8 ± 7,0] [ELISA (ELISA )]] (Tablica S1A). Kontrola (srednja vrijednost MoCA, 26,7 ± 2,2) imala je normalne razine biomarkera u likvoru.
Ljudski likvor karakterizira dinamički raspon obilja proteina, u kojemu albumin i drugi iznimno obilni proteini mogu spriječiti otkrivanje proteina od interesa (24). Kako bismo povećali dubinu otkrivanja proteina, uklonili smo prvih 14 visoko zastupljenih proteina iz svakog uzorka likvora prije analize masenom spektrometrijom (MS) (24). MS je identificiralo ukupno 39.805 peptida koji su mapirani na 3691 proteoma u 40 uzoraka. Kvantifikacija proteina provodi se višestrukim tandemskim masovnim označavanjem (TMT) (18, 25). Kako bismo riješili podatke koji nedostaju, uključili smo samo one proteine koji su kvantificirani u najmanje 50% uzoraka u naknadnoj analizi, čime smo konačno kvantificirali 2875 proteoma. Zbog značajne razlike u razinama ukupnog obilja proteina, kontrolni uzorak se statistički smatrao izvanrednim (13) i nije uključen u kasniju analizu. Vrijednosti abundancije preostalih 39 uzoraka prilagođene su prema dobi, spolu i kovarijanci serije (13-15, 17, 18, 20, 26).
Korištenjem statističke analize t-testa za procjenu diferencijalne ekspresije na regresijskom skupu podataka, ova je analiza identificirala proteine čije su razine obilja značajno promijenjene (P <0,05) između kontrolnih i AD slučajeva (Tablica S2A). Kao što je prikazano na slici 1A, obilje od ukupno 225 proteina u AD je značajno smanjeno, a obilje od 303 proteina je značajno povećano. Ovi različito izraženi proteini uključuju nekoliko prethodno identificiranih AD markera u cerebrospinalnoj tekućini, kao što je protein tau povezan s mikrotubulama (MAPT; P = 3,52 × 10-8), neurofilament (NEFL; P = 6,56 × 10-3), protein 43 povezan s rastom. (GAP43; P = 1,46 × 10-5), protein koji veže masne kiseline 3 (FABP3; P = 2,00 × 10-5), kitinaza 3 kao 1 (CHI3L1; P = 4,44 × 10-6), neuralni granulin (NRGN; P = 3,43 × 10−4) i VGF faktor rasta živaca (VGF; P = 4,83 × 10−3) (4-6). Međutim, identificirali smo i druge vrlo važne mete, kao što je inhibitor GDP disocijacije 1 (GDI1; P = 1,54 × 10-10) i modularno vezanje kalcija povezano sa SPARC-om 1 (SMOC1; P = 6,93 × 10-9) . Gene Ontology (GO) analiza 225 značajno smanjenih proteina otkrila je blisku povezanost s procesima tjelesnih tekućina kao što su metabolizam steroida, koagulacija krvi i aktivnost hormona (Slika 1B i Tablica S2B). Nasuprot tome, značajno povećani protein 303 usko je povezan sa strukturom stanica i energetskim metabolizmom.
(A) Dijagram vulkana pokazuje promjenu putanja log2 (x-os) u odnosu na -log10 statističku P vrijednost (y-os) dobivenu t-testom, koji se koristi za otkrivanje diferencijalne ekspresije između kontrole (CT) i AD slučajevi CSF proteoma Od svih proteina. Proteini sa značajno smanjenim razinama (P <0,05) u AD prikazani su plavom bojom, dok su proteini sa značajno povišenim razinama u bolesti prikazani crvenom bojom. Odabrani protein je označen. (B) Glavni pojmovi GO koji se odnose na proteine značajno su smanjeni (plavo) i povećani (crveno) u AD. Prikazuje tri pojma GO s najvišim z-rezultatima u poljima bioloških procesa, molekularnih funkcija i staničnih komponenti. (C) MS izmjerena razina MAPT u uzorku likvora (lijevo) i njegova korelacija s razinom tau uzorka ELISA (desno). Prikazuje se Pearsonov koeficijent korelacije s relevantnom P vrijednošću. Zbog nedostatka ELISA podataka za jedan slučaj AD, ove brojke uključuju vrijednosti za 38 od 39 analiziranih slučajeva. (D) Nadzirana analiza klastera (P <0,0001, Benjamini-Hochberg (BH) prilagođeni P <0,01) na kontrolnim i AD CSF uzorcima je pronašla korištenje 65 najznačajnije promijenjenih proteina u skupu podataka. Standardizirati, normalizirati.
Proteomska razina MAPT-a usko je povezana s neovisno izmjerenom ELISA tau razinom (r = 0,78, P = 7,8 × 10-9; slika 1C), podupirući valjanost našeg MS mjerenja. Nakon probave tripsina na razini proteina prekursora amiloida (APP), peptidi specifični za izoformu mapirani na C-kraj Aβ1-40 i Aβ1-42 ne mogu se učinkovito ionizirati (27, 28). Stoga, APP peptidi koje smo identificirali nemaju nikakve veze s ELISA Aβ1-42 razinama. Kako bismo procijenili diferencijalnu ekspresiju svakog slučaja, upotrijebili smo različito izražene proteine s P <0,0001 [korigirana stopa lažnog otkrivanja (FDR) P <0,01] kako bismo izvršili nadziranu klaster analizu uzoraka (Tablica S2A). Kao što je prikazano na slici 1D, ovih 65 visoko značajnih proteina može ispravno grupirati uzorke prema stanju bolesti, osim jednog slučaja AD sa karakteristikama sličnim kontroli. Od ovih 65 proteina, 63 su porasla u AD, dok su samo dva (CD74 i ISLR) smanjena. Ukupno, ove analize cerebrospinalne tekućine identificirale su stotine proteina u AD-u koji mogu poslužiti kao biomarkeri bolesti.
Zatim smo izvršili neovisnu mrežnu analizu moždanog proteoma AD. Kohorta mozga ovog otkrića uključivala je dorzolateralni prefrontalni korteks (DLPFC) iz kontrole (n = 10), Parkinsonove bolesti (PD; n = 10), mješovite AD/PD (n = 10) i AD (n = 10) slučajeva. ) Uzorak. Emery Goizueta ADRC. Demografski podaci ovih 40 slučajeva prethodno su opisani (25) i sažeti su u tablici S1B. Koristili smo TMT-MS za analizu ovih 40 moždanih tkiva i kohortu replikacije od 27 slučajeva. Ukupno su ova dva skupa podataka o mozgu proizvela 227 121 jedinstvenih peptida koji su mapirani na 12 943 proteoma (25). Samo oni proteini koji su kvantificirani u najmanje 50% slučajeva uključeni su u daljnja ispitivanja. Konačni skup podataka o otkriću sadrži 8817 kvantificiranih proteina. Prilagodite razine obilja proteina na temelju dobi, spola i post mortem intervala (PMI). Analiza diferencijalne ekspresije skupa podataka nakon regresije pokazala je da je >2000 razina proteina značajno promijenjeno [P <0,05, analiza varijance (ANOVA)] u dvije ili više kohorti bolesti. Zatim smo proveli nadziranu analizu klastera na temelju različito izraženih proteina i P <0,0001 u usporedbama AD/kontrola i/ili AD/PD (Slika S2, A i B, Tablica S2C). Ovih 165 visoko promijenjenih proteina jasno prikazuje slučajeve s AD patologijom iz kontrolnih i PD uzoraka, potvrđujući snažne AD specifične promjene u cijelom proteomu.
Zatim smo upotrijebili algoritam pod nazivom Weighted Gene Co-expression Network Analysis (WGCNA) za izvođenje mrežne analize na otkrivenom moždanom proteomu, koji organizira skup podataka u proteinske module sa sličnim obrascima ekspresije (11-13). Analiza je identificirala 44 modula (M) koeksprimiranih proteina, razvrstanih i numeriranih od najvećih (M1, n = 1821 proteina) do najmanjih (M44, n = 34 proteina) (Slika 2A i Tablica S2D)). Kao što je gore spomenuto (13) Izračunajte reprezentativni profil ekspresije ili karakteristični protein svakog modula i povežite ga sa stanjem bolesti i patologijom AD, odnosno uspostavite savez Registra Alzheimerove bolesti (CERAD) i Braak Score (Slika 2B). Sveukupno, 17 modula bilo je značajno povezano s AD neuropatologijom (P <0,05). Mnogi od ovih modula povezanih s bolešću također su bogati markerima specifičnim za stanični tip (Slika 2B). Kao što je gore spomenuto (13), obogaćivanje vrste stanice utvrđuje se analizom preklapanja modula i referentnog popisa gena specifičnih za vrstu stanice. Ovi geni su izvedeni iz objavljenih podataka u izoliranim mišjim neuronima, endotelnim i glija stanicama. Eksperiment RNA sekvenciranja (RNA-seq) (29).
(A) Otkrijte WGCNA proteoma mozga. (B) Analiza srednje korelacije dvotežine (BiCor) proteina modularnog potpisa (prva glavna komponenta ekspresije modularnog proteina) s neuropatološkim karakteristikama AD (gore), uključujući rezultate CERAD (Aβ plak) i Braak (tau tangles). Intenziteti pozitivnih (crveno) i negativnih (plavo) korelacija prikazani su toplinskom kartom u dvije boje, a zvjezdice označavaju statističku značajnost (P <0,05). Upotrijebite Hipergeometrijski Fisherov egzaktni test (FET) (dolje) za procjenu povezanosti tipa stanice svakog proteinskog modula. Intenzitet crvenog sjenčanja označava stupanj obogaćenosti vrste stanica, a zvjezdica označava statističku značajnost (P <0,05). Koristite BH metodu da ispravite P vrijednost izvedenu iz FET-a. (C) GO analiza modularnih proteina. Najbliže povezani biološki procesi prikazani su za svaki modul ili povezanu skupinu modula. oligo, oligodendrocit.
Skup od pet blisko povezanih modula bogatih astrocitima i mikroglijom (M30, M29, M18, M24 i M5) pokazao je jaku pozitivnu korelaciju s neuropatologijom AD (Slika 2B). Ontološka analiza povezuje ove glijalne module sa staničnim rastom, proliferacijom i imunitetom (Slika 2C i Tablica S2E). Dva dodatna glijalna modula, M8 i M22, također su snažno pojačano regulirana u bolesti. M8 je visoko povezan s putem receptora sličnim Tollu, signalnom kaskadom koja ima ključnu ulogu u urođenom imunološkom odgovoru (30). U isto vrijeme, M22 je usko povezan s posttranslacijskom modifikacijom. M2, koji je bogat oligodendrocitima, pokazuje snažnu pozitivnu korelaciju s patologijom AD i ontološku povezanost sa sintezom nukleozida i replikacijom DNA, što ukazuje na pojačanu proliferaciju stanica u bolestima. Sve u svemu, ovi nalazi podupiru povišenje glijalnih modula koje smo prethodno uočili u AD mrežnom proteomu (13, 17). Trenutno je utvrđeno da mnogi glijalni moduli povezani s AD-om u mreži pokazuju niže razine ekspresije u kontrolnim slučajevima i slučajevima PD-a, naglašavajući njihovu specifičnost bolesti koja je povišena u AD-u (slika S2C).
Samo četiri modula u našem mrežnom proteomu (M1, M3, M10 i M32) snažno su negativno povezana s patologijom AD (P <0,05) (Slika 2, B i C). I M1 i M3 bogati su neuronskim markerima. M1 je usko povezan sa sinaptičkim signalima, dok je M3 usko povezan s funkcijom mitohondrija. Nema dokaza o obogaćivanju tipa stanica za M10 i M32. M32 odražava vezu između M3 i staničnog metabolizma, dok je M10 jako povezan s rastom stanica i funkcijom mikrotubula. U usporedbi s AD-om, sva četiri modula su povećana u kontroli i PD-u, dajući im AD promjene specifične za bolest (Slika S2C). Sve u svemu, ovi rezultati podupiru smanjenu brojnost modula bogatih neuronima koje smo prethodno uočili u AD (13, 17). Ukratko, mrežna analiza moždanog proteoma koju smo otkrili proizvela je specifično izmijenjene module za AD u skladu s našim prethodnim nalazima.
AD karakterizira rani asimptomatski stadij (AsymAD), u kojem pojedinci pokazuju nakupljanje amiloida bez kliničkog kognitivnog pada (5, 31). Ova asimptomatska faza predstavlja kritičan prozor za rano otkrivanje i intervenciju. Prethodno smo pokazali snažno modularno očuvanje proteoma mreže mozga AsymAD i AD u neovisnim skupovima podataka (13, 17). Kako bismo osigurali da je moždana mreža koju smo trenutno otkrili u skladu s ovim prethodnim nalazima, analizirali smo očuvanje 44 modula u repliciranom skupu podataka iz 27 DLPFC organizacija. Ove organizacije uključuju slučajeve kontrole (n = 10), AsymAD (n = 8) i AD (n = 9). Kontrolni i AD uzorci uključeni su u analizu naše kohorte mozga otkrića (tablica S1B), dok su slučajevi AsymAD bili jedinstveni samo u kohorti replikacije. Ovi AsymAD slučajevi također su došli iz banke mozga Emory Goizueta ADRC. Iako je kognicija bila normalna u trenutku smrti, razine amiloida bile su abnormalno visoke (srednji CERAD, 2,8 ± 0,5) (Tablica S1B).
TMT-MS analiza ovih 27 moždanih tkiva rezultirala je kvantificiranjem 11 244 proteoma. Ovaj konačni broj uključuje samo one proteine kvantificirane u najmanje 50% uzoraka. Ovaj replicirani skup podataka sadrži 8638 (98,0%) od 8817 proteina otkrivenih u našoj analizi mozga otkrića i ima gotovo 3000 značajno promijenjenih proteina između kontrolne i AD kohorte (P <0,05, nakon Tukeyeva uparenog t testa za analizu varijance) ( Tablica S2F). Među ovim različito eksprimiranim proteinima, 910 također je pokazalo značajne promjene razine između AD i slučajeva kontrole proteoma mozga (P <0,05, nakon ANOVA Tukey uparenog t-testa). Vrijedno je napomenuti da je ovih 910 markera vrlo dosljedno u smjeru promjene između proteoma (r = 0,94, P <1,0 × 10-200) (Slika S3A). Među povećanim proteinima, proteini s najdosljednijim promjenama između skupova podataka uglavnom su članovi M5 i M18 modula bogatih glijom (MDK, COL25A1, MAPT, NTN1, SMOC1 i GFAP). Među smanjenim proteinima, oni s najdosljednijim promjenama bili su gotovo isključivo članovi M1 modula (NPTX2, VGF i RPH3A) povezani sa sinapsom. Nadalje smo verificirali promjene midkina (MDK), CD44, izlučenog proteina 1 (SFRP1) i VGF-a povezane s AD-om Western blotom (slika S3B). Analiza očuvanja modula pokazala je da je oko 80% proteinskih modula (34/44) u proteomu mozga značajno očuvano u skupu podataka replikacije (z-rezultat> 1,96, FDR korigirani P <0,05) (Slika S3C). Četrnaest od ovih modula bilo je posebno rezervirano između dva proteoma (z-rezultat> 10, FDR ispravljeni P <1,0 × 10-23). Sve u svemu, otkriće i replikacija visokog stupnja dosljednosti u diferencijalnoj ekspresiji i modularnom sastavu između proteoma mozga naglašava ponovljivost promjena u proteinima AD frontalnog korteksa. Osim toga, također je potvrđeno da AsymAD i naprednije bolesti imaju vrlo sličnu strukturu moždane mreže.
Detaljnija analiza diferencijalne ekspresije u skupu podataka o replikaciji mozga naglašava značajan stupanj promjena proteina AsymAD, uključujući ukupno 151 značajno promijenjen protein između AsymAD i kontrole (P <0,05) (Slika S3D). U skladu s opterećenjem amiloida, APP u mozgu AsymAD i AD značajno se povećao. MAPT se značajno mijenja samo kod AD, što je u skladu s povećanim razinama zapetljanja i njegovom poznatom korelacijom s kognitivnim padom (5, 7). Moduli bogati glijom (M5 i M18) snažno se odražavaju na povećanje proteina u AsymAD-u, dok je modul M1 povezan s neuronima najreprezentativniji od smanjenih proteina u AsymAD-u. Mnogi od ovih AsymAD markera pokazuju veće promjene u simptomatskim bolestima. Među tim markerima je SMOC1, glijalni protein koji pripada M18, a koji je povezan s tumorima mozga i razvojem očiju i udova (32). MDK je heparin-vezujući faktor rasta povezan sa staničnim rastom i angiogenezom (33), još jedan član M18. U usporedbi s kontrolnom skupinom, AsymAD je značajno porastao, praćen većim porastom AD-a. Nasuprot tome, sinaptički protein neuropentraksin 2 (NPTX2) značajno je smanjen u AsymAD mozgu. NPTX2 se prethodno povezivao s neurodegeneracijom i ima prepoznatu ulogu u posredovanju ekscitacijskih sinapsi (34). Sveukupno, ovi rezultati otkrivaju niz različitih predkliničkih promjena proteina u AD-u za koje se čini da napreduju s težinom bolesti.
S obzirom na to da smo otkrićem moždanog proteoma postigli značajnu dubinu proteinske pokrivenosti, pokušavamo potpunije razumjeti njegovo preklapanje s AD transkriptomom na mrežnoj razini. Stoga smo usporedili moždani proteom koji smo otkrili s modulom koji smo prethodno generirali iz mjerenja mikromreža 18 204 gena u AD (n = 308) i kontrolnim (n = 157) DLPFC tkivima (13). preklapanje. Ukupno smo identificirali 20 različitih RNA modula, od kojih su mnogi pokazali obogaćivanje specifičnih tipova stanica, uključujući neurone, oligodendrocite, astrocite i mikrogliju (Slika 3A). Višestruke promjene ovih modula u AD prikazane su na slici 3B. U skladu s našom prethodnom analizom preklapanja proteina i RNK korištenjem dubljeg neobilježenog MS proteoma (oko 3000 proteina) (13), većina od 44 modula u mreži proteoma mozga koje smo pronašli nalazi se u mreži transkriptoma. Nema značajnog preklapanja. Čak ni u naše otkriće i replikacija 34 proteinska modula koji su visoko zadržani u proteomu mozga, samo 14 (~40%) je prošlo Fisherov egzaktni test (FET) pokazalo se da ima statistički značajno preklapanje s transkriptomom (Slika 3A). Kompatibilan s popravkom oštećenja DNK (P-M25 i P-M19), translacijom proteina (P-M7 i P-M20), vezanjem/spajanjem RNK (P-M16 i P-M21) i ciljanjem proteina (P-M13 i P- M23) ne preklapa se s modulima u transkriptomu. Stoga, iako se u trenutnoj analizi preklapanja koristi dublji skup podataka o proteomu (13), većina proteoma AD mreže nije preslikana na mrežu transkriptoma.
(A) Hipergeometrijski FET pokazuje obogaćivanje markera specifičnih za tip stanice u RNA modulu AD transkriptoma (gore) i stupanj preklapanja između RNA (x-os) i proteinskih (y-os) modula AD mozga (dolje) . Intenzitet crvenog sjenčanja označava stupanj obogaćenosti tipova stanica na gornjoj ploči i intenzitet preklapanja modula na donjoj ploči. Zvjezdice označavaju statističku značajnost (P <0,05). (B) Stupanj korelacije između karakterističnih gena svakog modula transkriptoma i AD statusa. Moduli s lijeve strane u najnegativnijoj su korelaciji s AD (plavo), a oni s desne strane u najpozitivnijoj korelaciji s AD (crveno). Log-transformirana BH-korigirana vrijednost P pokazuje stupanj statističke značajnosti svake korelacije. (C) Značajno preklapajući moduli sa zajedničkim obogaćivanjem tipa ćelije. (D) Analiza korelacije log2 puta promjene obilježenog proteina (x-os) i RNA (y-os) u preklapajućem modulu. Prikazuje se Pearsonov koeficijent korelacije s relevantnom P vrijednošću. Mikro, mikroglija; nebeska tijela, astrociti. CT, kontrola.
Većina proteinskih i RNA modula koji se preklapaju dijele slične profile obogaćivanja tipa stanica i dosljedne smjerove promjene AD (Slika 3, B i C). Drugim riječima, modul M1 moždanog proteoma (PM1) povezan sa sinapsama mapiran je na tri homologna RNA modula bogata neuronima (R-M1, R-M9 i R-M16), koji su u AD. Oba su pokazala smanjenu razinu. Slično, proteinski moduli M5 i M18 bogati glijom preklapaju se s modulima RNA bogatim astrocitima i mikroglijalnim markerima (R-M3, R-M7 i R-M10) i jako su uključeni u porast bolesti. Ove zajedničke modularne značajke između dva skupa podataka dodatno podupiru obogaćivanje vrste stanica i promjene povezane s bolešću koje smo primijetili u proteomu mozga. Međutim, uočili smo mnoge značajne razlike između razine RNA i proteina pojedinačnih markera u tim zajedničkim modulima. Korelacijska analiza diferencijalne ekspresije proteomike i transkriptomike molekula unutar ovih preklapajućih modula (Slika 3D) naglašava ovu nedosljednost. Na primjer, APP i nekoliko drugih proteina glijalnog modula (NTN1, MDK, COL25A1, ICAM1 i SFRP1) pokazali su značajan porast u AD proteomu, ali nije bilo gotovo nikakve promjene u AD transkriptomu. Ove promjene specifične za proteine mogu biti usko povezane s amiloidnim plakovima (23, 35), ističući proteom kao izvor patoloških promjena, a te se promjene možda neće odraziti na transkriptom.
Nakon neovisne analize proteoma mozga i CSF-a koje smo otkrili, proveli smo sveobuhvatnu analizu dvaju skupova podataka kako bismo identificirali biomarkere AD CSF-a povezane s patofiziologijom mreže mozga. Prvo moramo definirati preklapanje dvaju proteoma. Iako je široko prihvaćeno da likvor odražava neurokemijske promjene u AD mozgu (4), nije jasan točan stupanj preklapanja između AD mozga i proteoma likvora. Uspoređujući broj zajedničkih genskih proizvoda otkrivenih u naša dva proteoma, otkrili smo da je gotovo 70% (n = 1936) proteina identificiranih u cerebrospinalnoj tekućini također kvantificirano u mozgu (Slika 4A). Većina ovih proteina koji se preklapaju (n = 1721) mapirani su na jedan od 44 modula koekspresije iz skupa podataka o mozgu otkrića (Slika 4B). Kao što se očekivalo, šest najvećih moždanih modula (M1 do M6) pokazalo je najveću količinu preklapanja likvora. Međutim, postoje manji moždani moduli (na primjer, M15 i M29) koji postižu neočekivano visok stupanj preklapanja, veći od dvostruko većeg moždanog modula. To nas motivira da usvojimo detaljniju, statistički vođenu metodu za izračunavanje preklapanja između mozga i cerebrospinalne tekućine.
(A i B) Proteini otkriveni u skupovima podataka o mozgu otkrića i likvoru preklapaju se. Većina ovih preklapajućih proteina povezana je s jednim od 44 modula koekspresije mreže koekspresije mozga. (C) Otkrijte preklapanje između proteoma cerebrospinalne tekućine i proteoma moždane mreže. Svaki red toplinske karte predstavlja zasebnu analizu preklapanja hipergeometrijskog FET-a. Gornji red prikazuje preklapanje (sivo/crno sjenčanje) između moždanog modula i cijelog proteoma CSF-a. Drugi redak prikazuje da je preklapanje između moždanih modula i CSF proteina (osjenčanog crvenom bojom) značajno pojačano u AD (P <0,05). Treći redak pokazuje da je preklapanje između moždanih modula i CSF proteina (plavo sjenčanje) značajno smanjeno u AD (P <0,05). Koristite BH metodu da ispravite P vrijednost izvedenu iz FET-a. (D) Ploča sklopivog modula temeljena na povezanosti tipa ćelije i povezanih GO pojmova. Ovi paneli sadrže ukupno 271 protein vezan uz mozak, koji imaju značajnu diferencijalnu ekspresiju u proteomu CSF-a.
Koristeći jednostrane FET-ove, procijenili smo važnost proteinskog preklapanja između proteoma CSF-a i pojedinačnih moždanih modula. Analiza je otkrila da ukupno 14 moždanih modula u skupu podataka CSF ima statistički značajna preklapanja (FDR prilagođeni P <0,05) i dodatni modul (M18) čije je preklapanje blizu značajnosti (FDR prilagođeni P = 0,06) (Slika 4C , gornji red). Također smo zainteresirani za module koji se snažno preklapaju s različito izraženim CSF proteinima. Stoga smo primijenili dvije dodatne FET analize kako bismo odredili koji je od (i) CSF proteina bio značajno povećan u AD i (ii) CSF proteina bio je značajno smanjen u AD (P <0,05, upareni t test AD/kontrola) Moduli mozga sa značajnim preklapanjem između njih. Kao što je prikazano u srednjem i donjem retku slike 4C, ove dodatne analize pokazuju da se 8 od 44 moždana modula značajno preklapaju s proteinom dodanim u AD CSF (M12, M1, M2, M18, M5, M44, M33 i M38) . ), dok su samo dva modula (M6 i M15) pokazala značajno preklapanje sa smanjenim proteinom u AD CSF. Kao što se očekivalo, svih 10 modula nalazi se u 15 modula s najvećim preklapanjem s proteomom CSF-a. Stoga pretpostavljamo da su ovih 15 modula visokoučinkoviti izvori biomarkera likvora koji potiču iz mozga.
Ovih 15 modula koji se preklapaju sastavili smo u pet velikih proteinskih panela na temelju njihove blizine u WGCNA dijagramu stabla i njihove povezanosti s tipovima stanica i ontologijom gena (Slika 4D). Prva ploča sadrži module bogate neuronskim markerima i proteinima povezanim sa sinapsama (M1 i M12). Sinaptički panel sadrži ukupno 94 proteina, a razine u proteomu likvora značajno su se promijenile, čineći ga najvećim izvorom moždanih markera likvora među pet panela. Druga skupina (M6 i M15) pokazala je blisku povezanost s markerima endotelnih stanica i vaskularnim tijelom, kao što je "cijeljenje rana" (M6) i "regulacija humoralnog imunološkog odgovora" (M15). M15 je također vrlo povezan s metabolizmom lipoproteina, koji je usko povezan s endotelom (36). Vaskularni panel sadrži 34 CSF markera koji se odnose na mozak. Treća skupina uključuje module (M2 i M4) koji su značajno povezani s oligodendrocitnim markerima i staničnom proliferacijom. Na primjer, pojmovi ontologije najviše razine M2 uključuju "pozitivnu regulaciju replikacije DNA" i "proces biosinteze purina". U međuvremenu, oni od M4 uključuju "diferencijaciju glija stanica" i "segregaciju kromosoma". Ploča mijelinizacije sadrži 49 CSF markera povezanih s mozgom.
Četvrta skupina sadrži najviše modula (M30, M29, M18, M24 i M5), a gotovo svi moduli značajno su bogati mikroglijama i astrocitnim markerima. Slično ploči za mijelinizaciju, četvrta ploča također sadrži module (M30, M29 i M18) koji su usko povezani s proliferacijom stanica. Ostali moduli u ovoj skupini usko su povezani s imunološkim terminima, kao što su "proces imunološkog učinka" (M5) i "regulacija imunološkog odgovora" (M24). Glijalna imunološka skupina sadrži 42 CSF markera povezana s mozgom. Konačno, posljednja ploča uključuje 52 markera povezana s mozgom na četiri modula (M44, M3, M33 i M38), a svi su na tijelu povezani sa skladištenjem energije i metabolizmom. Najveći od ovih modula (M3) usko je povezan s mitohondrijima i bogat je markerima specifičnim za neurone. M38 je jedan od manjih članova modula u ovom metabolomu i također pokazuje umjerenu specifičnost neurona.
Sveukupno, ovih pet panela odražava širok raspon tipova stanica i funkcija u AD korteksu i zajedno sadrže 271 biljeg likvora povezan s mozgom (Tablica S2G). Kako bismo procijenili valjanost ovih MS rezultata, upotrijebili smo proximity extension assay (PEA), ortogonalnu tehnologiju temeljenu na antitijelima s mogućnostima multipleksiranja, visokom osjetljivošću i specifičnošću, i ponovno analizirali uzorke cerebrospinalne tekućine koje smo pronašli. Podskup ovih 271 biomarkera (n = 36). Ovih 36 ciljeva demonstrira promjenu AD multiplika PEA, koja je usko povezana s našim nalazima temeljenim na MS-u (r = 0,87, P = 5,6 × 10-12), što je snažno potvrdilo rezultate naše sveobuhvatne MS analize (Slika S4 ).
Biološke teme koje naglašava naših pet skupina, od sinaptičke signalizacije do energetskog metabolizma, sve su povezane s patogenezom AD (1-3). Stoga je svih 15 modula koji sadrže ove panele povezano s patologijom AD u proteomu mozga koju smo otkrili (Slika 2B). Najznačajnija je visoka pozitivna patološka korelacija između naših glijalnih modula i jaka negativna patološka korelacija između naših najvećih neuronskih modula (M1 i M3). Analiza diferencijalne ekspresije našeg repliciranog moždanog proteoma (Slika S3D) također ističe glijalne proteine izvedene iz M5 i M18. Kod AsymAD-a i simptomatskog AD-a, najveći porast glijalnih proteina i sinapsi povezanih s M1 Protein se najviše smanjuje. Ova opažanja pokazuju da je 271 marker cerebrospinalne tekućine koji smo identificirali u pet skupina povezan s procesima bolesti u AD korteksu, uključujući one koji se javljaju u ranim asimptomatskim stadijima.
Kako bismo bolje analizirali smjer promjene panela proteina u mozgu i spinalnoj tekućini, nacrtali smo sljedeće za svaki od 15 modula koji se preklapaju: (i) pronašli smo razinu zastupljenosti modula u skupu podataka o mozgu i (ii) modul protein Razlika je izražena u cerebrospinalnoj tekućini (Slika S5). Kao što je ranije spomenuto, WGCNA se koristi za određivanje količine modula ili karakteristične vrijednosti proteina u mozgu (13). Karta vulkana koristi se za opisivanje diferencijalne ekspresije modularnih proteina u cerebrospinalnoj tekućini (AD/kontrola). Ove brojke pokazuju da tri od pet panela pokazuju različite trendove ekspresije u mozgu i spinalnoj tekućini. Dva modula panela sinapsi (M1 i M12) pokazuju smanjenje razine obilja u AD mozgu, ali se značajno preklapaju s povećanim proteinom u AD CSF (Slika S5A). Moduli povezani s neuronima koji sadrže metabolome (M3 i M38) pokazali su nedosljedne slične obrasce ekspresije mozga i cerebrospinalne tekućine (slika S5E). Vaskularni panel također je pokazao različite trendove ekspresije, iako su njegovi moduli (M6 i M15) bili umjereno povećani u AD mozgu i smanjeni u oboljelom likvoru (Slika S5B). Preostale dvije ploče sadrže velike glijalne mreže čiji su proteini dosljedno pojačano regulirani u oba odjeljka (Slika S5, C i D).
Napominjemo da ovi trendovi nisu zajednički svim markerima na ovim pločama. Na primjer, sinaptički panel uključuje nekoliko proteina koji su značajno smanjeni u AD mozgu i likvoru (Slika S5A). Među ovim niže reguliranim markerima cerebrospinalne tekućine su NPTX2 i VGF od M1, i kromogranin B od M12. Međutim, unatoč tim iznimkama, većina naših sinaptičkih markera je povišena u AD spinalnoj tekućini. Sve u svemu, ove su analize uspjele razlikovati statistički značajne trendove u razinama mozga i cerebrospinalne tekućine u svakom od naših pet panela. Ovi trendovi naglašavaju složen i često različit odnos između ekspresije proteina u mozgu i likvoru kod AD.
Zatim smo upotrijebili MS replikacijsku analizu visoke propusnosti (replikacija CSF-a 1) kako bismo suzili naš 271 skup biomarkera na ciljeve koji najviše obećavaju i koji se mogu ponoviti (Slika 5A). CSF kopija 1 sadrži ukupno 96 uzoraka iz Emory Goizueta ADRC, uključujući kontrolu, AsymAD i AD kohortu (Tablica S1A). Ove slučajeve AD karakterizira blagi kognitivni pad (srednja vrijednost MoCA, 20,0 ± 3,8) i promjene u biomarkerima AD potvrđene u cerebrospinalnoj tekućini (Tablica S1A). Suprotno analizi likvora koju smo pronašli, ova se replikacija izvodi pomoću učinkovitije i propusnije "single-shot" MS metode (bez off-line frakcioniranja), uključujući pojednostavljeni protokol pripreme uzorka koji eliminira potrebu za imunodeplecijom pojedinačnih uzoraka . Umjesto toga, koristi se jedan "kanal za poboljšanje" osiromašenog imuniteta za pojačavanje signala manje zastupljenih proteina (37). Iako smanjuje ukupnu pokrivenost proteoma, ova jednokratna metoda značajno skraćuje strojno vrijeme i povećava broj TMT-označenih uzoraka koji se mogu analizirati kao održivi (17, 38). Ukupno je analizom identificirano 6487 peptida koji su mapirani na 1183 proteoma u 96 slučajeva. Kao i kod analize likvora koju smo otkrili, samo oni proteini koji su kvantificirani u najmanje 50% uzoraka uključeni su u naknadne izračune, a podaci su regresirani za učinke dobi i spola. To je dovelo do konačne kvantifikacije 792 proteoma, od kojih je 95% također identificirano u pronađenom skupu podataka CSF-a.
(A) Ciljevi proteina likvora povezani s mozgom verificirani u prvoj repliciranoj kohorti likvora i uključeni u konačni panel (n = 60). (B do E) Razine biomarkera panela (kompozitni z-rezultati) izmjerene u četiri skupine replikacije CSF-a. Upareni t-testovi ili ANOVA s Tukeyjevom naknadnom korekcijom korišteni su za procjenu statističke značajnosti promjena u obilju u svakoj analizi ponavljanja. CT, kontrola.
Budući da smo posebno zainteresirani za provjeru naših 271 meta CSF-a povezanih s mozgom kroz sveobuhvatnu analizu, ograničit ćemo daljnje ispitivanje ovog repliciranog proteoma na ove markere. Među ovih 271 proteina, 100 ih je otkriveno u replikaciji CSF 1. Slika S6A prikazuje diferencijalnu ekspresiju ovih 100 preklapajućih markera između kontrolnih i AD replikacijskih uzoraka. Sinaptički i metabolitski histoni najviše se povećavaju u AD, dok se vaskularni proteini najviše smanjuju u bolesti. Većina od 100 preklapajućih markera (n = 70) zadržala je isti smjer promjene u dva skupa podataka (Slika S6B). Ovih 70 validiranih markera likvora povezanih s mozgom (Tablica S2H) uvelike odražavaju prethodno opažene trendove ekspresije panela, to jest, regulaciju naniže vaskularnih proteina i regulaciju naviše svih ostalih panela. Samo 10 od ovih 70 potvrđenih proteina pokazalo je promjene u obilju AD koje su bile u suprotnosti s ovim panel trendovima. Kako bismo generirali panel koji najbolje odražava ukupni trend mozga i cerebrospinalne tekućine, isključili smo ovih 10 proteina iz panela od interesa koji smo konačno potvrdili (Slika 5A). Stoga naš panel u konačnici uključuje ukupno 60 proteina provjerenih u dvije neovisne kohorte AD CSF koristeći različite pripreme uzoraka i analizu MS platforme. Dijagrami ekspresije z-rezultata ovih konačnih panela u CSF kopiji 1 u kontrolnim i AD slučajevima potvrdili su trend panela uočen u kohorti CSF-a koju smo pronašli (Slika 5B).
Među ovih 60 proteina, postoje molekule za koje se zna da su povezane s AD-om, kao što je osteopontin (SPP1), koji je proupalni citokin koji je povezan s AD-om u mnogim studijama (39-41), i GAP43, sinaptički protein koji je jasno povezan s neurodegeneracijom (42). Najpotpunije provjereni proteini su markeri povezani s drugim neurodegenerativnim bolestima, kao što je superoksid dismutaza 1 (SOD1) povezana s amiotrofičnom lateralnom sklerozom (ALS) i desaharaza povezana s Parkinsonovom bolešću (PARK7). Također smo potvrdili da su mnogi drugi markeri, poput SMOC1 i signalnog proteina 1 za pričvršćivanje membrane bogatog mozgom (BASP1), ograničili prethodne veze s neurodegeneracijom. Vrijedno je napomenuti da nam je zbog njihove niske ukupne zastupljenosti u proteomu likvora teško upotrijebiti ovu visokoučinkovitu metodu jednostruke detekcije za pouzdano otkrivanje MAPT-a i nekih drugih proteina povezanih s AD-om (na primjer, NEFL i NRGN ) (43, 44).
Zatim smo provjerili ovih 60 oznaka prioritetne ploče u tri dodatne analize. U kopiji 2 likvora upotrijebili smo jedan TMT-MS za analizu neovisne skupine od 297 kontrolnih i AD uzoraka iz Emory Goizueta ADRC (17). Replikacija likvora 3 uključivala je ponovnu analizu dostupnih TMT-MS podataka od 120 kontrolnih pacijenata i pacijenata s AD-om iz Lausanne, Švicarska (45). Otkrili smo više od dvije trećine od 60 oznaka prioriteta u svakom skupu podataka. Iako je švicarska studija koristila različite MS platforme i metode kvantifikacije TMT (45, 46), snažno smo reproducirali naše panel trendove u dvije ponovljene analize (Slika 5, C i D, i Tablice S2, I i J). Kako bismo procijenili specifičnost bolesti naše skupine, upotrijebili smo TMT-MS za analizu četvrtog replikacijskog skupa podataka (replikacija likvora 4), koji nije uključivao samo kontrolne (n = 18) i AD (n = 17) slučajeve, već i PD ( n = 14), uzoraka ALS-a (n = 18) i frontotemporalne demencije (FTD) (n = 11) (Tablica S1A). Uspješno smo kvantificirali gotovo dvije trećine panela proteina u ovoj kohorti (38 od 60). Ovi rezultati ističu promjene specifične za AD u svih pet panela biomarkera (Slika 5E i Tablica S2K). Porast u skupini metabolita pokazao je najjaču AD specifičnost, a zatim skupina mijelinizacije i glija. U manjoj mjeri, FTD također pokazuje povećanje između ovih ploča, što može odražavati slične potencijalne mrežne promjene (17). Nasuprot tome, ALS i PD pokazali su gotovo iste profile mijelinizacije, glije i metaboloma kao kontrolna skupina. Sveukupno, unatoč razlikama u pripremi uzorka, MS platformi i TMT metodama kvantifikacije, ove ponovljene analize pokazuju da naši prioritetni panel markeri imaju vrlo dosljedne promjene specifične za AD u više od 500 jedinstvenih uzoraka likvora.
Neurodegeneracija AD široko je prepoznata nekoliko godina prije pojave kognitivnih simptoma, tako da postoji hitna potreba za biomarkerima AsymAD (5, 31). Međutim, sve više i više dokaza pokazuje da je biologija AsymAD-a daleko od homogene, a složena interakcija rizika i otpornosti dovodi do velikih individualnih razlika u daljnjem napredovanju bolesti (47). Iako se koriste za identifikaciju slučajeva AsymAD, razine osnovnih biomarkera likvora (Aβ1-42, ukupni tau i p-tau) nisu dokazale da mogu pouzdano predvidjeti tko će napredovati do demencije (4, 7), što ukazuje na više potrebno je uključiti holističke alate za biomarkere koji se temelje na višestrukim aspektima fiziologije mozga kako bi se točno stratificirao rizik ove populacije. Stoga smo naknadno analizirali našu AD-validiranu ploču biomarkera u AsymAD populaciji CSF kopije 1. Ovih 31 slučaj AsymAD pokazao je abnormalne osnovne razine biomarkera (Aβ1–42/ukupni tau ELISA omjer, <5,5) i potpunu kogniciju (srednji MoCA, 27,1 ± 2,2) (Tablica S1A). Osim toga, sve osobe s AsymAD-om imaju kliničku ocjenu demencije 0, što ukazuje da nema dokaza o padu dnevne kognitivne ili funkcionalne izvedbe.
Prvo smo analizirali razine validiranih panela u svih 96 replika likvora 1, uključujući kohortu AsymAD. Otkrili smo da je nekoliko panela u skupini AsymAD imalo značajne promjene u obilju slične AD-u, vaskularni panel pokazao je silazni trend u AsymAD-u, dok su svi ostali paneli pokazali uzlazni trend (Slika 6A). Stoga su svi paneli pokazali visoko značajnu korelaciju s ELISA Aβ1-42 i ukupnim razinama tau (Slika 6B). Nasuprot tome, korelacija između grupe i MoCA rezultata je relativno loša. Jedan od upečatljivijih nalaza iz ovih analiza je veliki raspon zastupljenosti panela u kohorti AsymAD. Kao što je prikazano na slici 6A, razina panela AsymAD grupe obično prelazi razinu panela kontrolne grupe i AD grupe, pokazujući relativno visoku varijabilnost. Kako bismo dodatno istražili ovu heterogenost AsymAD-a, primijenili smo analizu višedimenzionalnog skaliranja (MDS) na 96 slučajeva replikacije 1 likvora. MDS analiza omogućuje vizualizaciju sličnosti između slučajeva na temelju određenih varijabli u skupu podataka. Za ovu klaster analizu koristimo samo one validirane panel markere koji imaju statistički značajnu promjenu (P <0,05, AD/kontrola) u razini proteoma 1 otkrivanja i replikacije CSF (n = 29) (Tablica S2L). Ova analiza proizvela je jasno prostorno grupiranje između naše kontrole i AD slučajeva (Slika 6C). Nasuprot tome, neki AsymAD slučajevi jasno su grupirani u kontrolnoj skupini, dok su drugi locirani u AD slučajevima. Kako bismo dalje istražili ovu heterogenost AsymAD-a, upotrijebili smo našu MDS mapu za definiranje dvije skupine ovih AsymAD slučajeva. Prva skupina uključivala je slučajeve AsymAD grupirane bliže kontroli (n = 19), dok su drugu skupinu karakterizirali slučajevi AsymAD s profilom markera bližim AD (n = 12).
(A) Razina ekspresije (z-rezultat) skupine biomarkera likvora u svih 96 uzoraka u kohorti replikacije 1 likvora, uključujući AsymAD. Analiza varijance s Tukeyjevom naknadnom korekcijom korištena je za procjenu statističke značajnosti promjena obilja panela. (B) Korelacijska analiza razine obilja panela proteina (z-rezultat) s MoCA rezultatom i ukupnom razinom tau u ELISA Aβ1-42 i uzorcima CSF kopije 1. Prikazuje se Pearsonov koeficijent korelacije s relevantnom P vrijednošću. (C) MDS od 96 slučajeva CSF kopije 1 temeljio se na razinama obilja 29 validiranih panel markera, koji su značajno promijenjeni u skupovima podataka otkrića i CSF kopije 1 [P <0,05 AD/kontrola (CT)]. Ova analiza korištena je za podjelu AsymAD grupe na kontrolnu (n = 19) i AD (n = 12) podskupine. (D) Dijagram vulkana pokazuje diferencijalnu ekspresiju svih proteina replikacije 1 CSF-a s promjenom putanja log2 (x-os) u odnosu na -log10 statističku vrijednost P između dvije AsymAD podskupine. Panel biomarkeri su obojeni. (E) Razina obilja replikacije CSF 1 biomarkera selekcijske skupine različito se izražava između podskupina AsymAD. Za procjenu statističke značajnosti korištena je Tukeyeva naknadno prilagođena analiza varijance.
Ispitali smo diferencijalnu ekspresiju proteina između ovih kontrolnih i AD-sličnih AsymAD slučajeva (Slika 6D i Tablica S2L). Rezultirajuća karta vulkana pokazuje da se 14 oznaka ploče značajno promijenilo između dvije skupine. Većina ovih markera su članovi sinapse i metaboloma. Međutim, SOD1 i miristoilirani supstrat protein kinaze C bogat alaninom (MARCKS), koji su članovi mijelinske odnosno glijalne imunosne skupine, također pripadaju ovoj skupini (Slika 6, D i E). Vaskularna ploča također je doprinijela dvama markerima koji su bili značajno smanjeni u skupini AsymAD nalik na AD, uključujući AE vezni protein 1 (AEBP1) i člana obitelji komplementa C9. Nije bilo značajne razlike između kontrolne i AD-slične AsymAD podskupine u ELISA AB1-42 (P = 0,38) i p-tau (P = 0,28), ali je doista postojala značajna razlika u ukupnoj razini tau (P = 0,0031 ) (Slika S7). Postoji nekoliko panel markera koji pokazuju da su promjene između dvije podskupine AsymAD značajnije od ukupnih razina tau (na primjer, YWHAZ, SOD1 i MDH1) (Slika 6E). Sveukupno, ovi rezultati pokazuju da naš validirani panel može sadržavati biomarkere koji mogu podtipizirati i potencijalno riskirati stratifikaciju pacijenata s asimptomatskom bolešću.
Postoji hitna potreba za sustavnim alatima za biomarkere za bolje mjerenje i ciljanje različite patofiziologije iza AD. Očekuje se da će ti alati ne samo promijeniti naš dijagnostički okvir za AD, već i promicati usvajanje učinkovitih strategija liječenja specifičnih za pacijenta (1, 2). U tu smo svrhu primijenili nepristran sveobuhvatan proteomički pristup AD mozgu i likvoru kako bismo identificirali web-bazirane biomarkere likvora koji odražavaju širok raspon patofiziologije temeljene na mozgu. Naša analiza proizvela je pet panela biomarkera likvora, koji (i) odražavaju sinapse, krvne žile, mijelin, imunološku i metaboličku disfunkciju; (ii) pokazati snažnu obnovljivost na različitim MS platformama; (iii) Prikaži progresivne promjene specifične za bolest tijekom ranih i kasnih faza AD. Sveukupno, ova otkrića predstavljaju obećavajući korak prema razvoju raznolikih, pouzdanih, web-orijentiranih alata za biomarkere za istraživanje AD i kliničke primjene.
Naši rezultati pokazuju visoko očuvanu organizaciju proteoma moždane mreže AD i podržavaju njegovu upotrebu kao sidra za razvoj biomarkera koji se temelji na sustavu. Naša analiza pokazuje da dva neovisna TMT-MS skupa podataka koji sadrže AD i AsymAD mozgove imaju jaku modularnost. Ova otkrića proširuju naš prethodni rad, pokazujući očuvanje moćnih modula više od 2000 moždanih tkiva iz višestrukih neovisnih kohorti u frontalnom, parijetalnom i temporalnom korteksu (17). Ova konsenzusna mreža odražava različite promjene povezane s bolešću uočene u trenutačnim istraživanjima, uključujući povećanje upalnih modula bogatih glijama i smanjenje modula bogatih neuronima. Kao i trenutačno istraživanje, ova mreža velikih razmjera također ima značajne modularne promjene u AsymAD-u, pokazujući niz različitih pretkliničkih patofiziologija (17).
Međutim, unutar ovog visoko konzervativnog okvira temeljenog na sustavu, postoji više fino zrnate biološke heterogenosti, posebno među pojedincima u ranim fazama AD. Naš panel biomarkera može prikazati dvije podskupine u AsymAD-u, koje pokazuju značajnu diferencijalnu ekspresiju višestrukih CSF markera. Naša je skupina uspjela istaknuti biološke razlike između ove dvije podskupine, koje nisu bile očite na razini ključnih AD biomarkera. U usporedbi s kontrolnom skupinom, omjeri Aβ1-42/ukupni tau ovih AsymAD pojedinaca bili su abnormalno niski. Međutim, samo su ukupne razine tau bile značajno različite između dviju AsymAD podskupina, dok su razine Aβ1-42 i p-tau ostale relativno usporedive. Budući da se čini da je visok tau u likvoru bolji prediktor kognitivnih simptoma od razine Aβ1-42 (7), sumnjamo da dvije kohorte AsymAD mogu imati različite rizike od progresije bolesti. S obzirom na ograničenu veličinu uzorka našeg AsymAD-a i nedostatak longitudinalnih podataka, potrebna su daljnja istraživanja kako bismo pouzdano izveli ove zaključke. Međutim, ovi rezultati pokazuju da panel likvora temeljen na sustavu može poboljšati našu sposobnost učinkovite stratifikacije pojedinaca tijekom asimptomatskog stadija bolesti.
Sve u svemu, naši nalazi podupiru ulogu višestrukih bioloških funkcija u patogenezi AD. Međutim, neregulirani energetski metabolizam postao je istaknuta tema svih naših pet validiranih ploča za označavanje. Metabolički proteini, kao što su hipoksantin-gvanin fosforiboziltransferaza 1 (HPRT1) i laktat dehidrogenaza A (LDHA), najsnažniji su potvrđeni sinaptički biomarkeri, što ukazuje na to da je porast AD CSF vrlo reproducibilan spol. Naše krvne žile i glijalne ploče također sadrže nekoliko markera uključenih u metabolizam oksidativnih tvari. Ovi su nalazi u skladu s ključnom ulogom koju metabolički procesi igraju u cijelom mozgu, ne samo da zadovolje visoke energetske potrebe neurona, već i da zadovolje visoke energetske potrebe astrocita i drugih glija stanica (17, 48). Naši rezultati podupiru sve više dokaza da promjene u redoks potencijalu i prekid energetskih putova mogu biti središnja veza između nekoliko ključnih procesa uključenih u patogenezu AD-a, uključujući mitohondrijske poremećaje, upalu posredovanu glijom i vaskularna oštećenja (49). Osim toga, biomarkeri metaboličke cerebrospinalne tekućine sadrže velik broj različito bogatih proteina između naše kontrolne i AD-slične AsymAD podskupine, što sugerira da bi poremećaj tih energetskih i redoks putova mogao biti kritičan u pretkliničkoj fazi bolesti.
Različiti trendovi panela mozga i cerebrospinalne tekućine koje smo uočili također imaju zanimljive biološke implikacije. Sinapse i metabolomi bogati neuronima pokazuju smanjene razine u AD mozgu i povećanu količinu u cerebrospinalnoj tekućini. S obzirom da su neuroni bogati mitohondrijima koji proizvode energiju u sinapsama kako bi osigurali energiju za svoje brojne specijalizirane signale (50), očekivana je sličnost profila ekspresije ovih dviju skupina neurona. Gubitak neurona i ekstruzija oštećenih stanica mogu objasniti ove trendove panela mozga i CSF-a u kasnijoj bolesti, ali ne mogu objasniti rane promjene panela koje opažamo (13). Jedno moguće objašnjenje ovih nalaza u ranoj asimptomatskoj bolesti je abnormalno sinaptičko obrezivanje. Novi dokazi u mišjim modelima sugeriraju da se sinaptička fagocitoza posredovana mikroglijom može abnormalno aktivirati u AD-u i dovesti do ranog gubitka sinapse u mozgu (51). Ovaj odbačeni sinaptički materijal može se akumulirati u likvoru, zbog čega promatramo povećanje likvora u neuronskoj ploči. Imunološki posredovano sinaptičko obrezivanje također može djelomično objasniti povećanje glijalnih proteina koje opažamo u mozgu i cerebrospinalnoj tekućini tijekom procesa bolesti. Osim sinaptičkog rezanja, sveukupne abnormalnosti u egzocitnom putu također mogu dovesti do različitih ekspresija neuronskih markera u mozgu i likvoru. Niz studija pokazalo je da se promijenio sadržaj egzosoma u patogenezi AD mozga (52). Izvanstanični put također je uključen u proliferaciju Ap (53, 54). Vrijedno je napomenuti da supresija egzosomalne sekrecije može smanjiti patologiju sličnu AD-u u transgenim mišjim modelima AD (55).
U isto vrijeme, protein u vaskularnom panelu pokazao je umjeren porast u AD mozgu, ali značajno smanjen u CSF-u. Disfunkcija krvno-moždane barijere (BBB) može djelomično objasniti ove nalaze. Mnoge neovisne postmortalne studije na ljudima pokazale su razgradnju BBB kod AD (56, 57). Ove studije potvrdile su različite abnormalne aktivnosti koje okružuju ovaj čvrsto zatvoreni sloj endotelnih stanica, uključujući curenje moždanih kapilara i perivaskularno nakupljanje proteina koji se prenose krvlju (57). Ovo može dati jednostavno objašnjenje za povišene vaskularne proteine u mozgu, ali ne može u potpunosti objasniti smanjenje tih istih proteina u cerebrospinalnoj tekućini. Jedna je mogućnost da središnji živčani sustav aktivno izolira te molekule kako bi riješio problem povećane upale i oksidativnog stresa. Smanjenje nekih od najtežih likvorskih proteina u ovoj ploči, posebno onih uključenih u regulaciju lipoproteina, povezano je s inhibicijom štetnih razina upale i neuroprotektivnog procesa reaktivnih kisikovih vrsta. To vrijedi za paroksonazu 1 (PON1), enzim koji veže lipoproteine odgovoran za smanjenje razine oksidativnog stresa u cirkulaciji (58, 59). Prekursor alfa-1-mikroglobulina/bikunina (AMBP) još je jedan marker vaskularne skupine sa značajno smanjenom regulacijom. On je prekursor transportera lipida bikunina, koji je također uključen u suzbijanje upale i neurološku zaštitu (60, 61).
Unatoč raznim zanimljivim hipotezama, nemogućnost izravnog otkrivanja biokemijskih mehanizama bolesti dobro je poznato ograničenje proteomske analize potaknute otkrićima. Stoga su potrebna daljnja istraživanja kako bi se pouzdano definirali mehanizmi koji stoje iza ovih panela biomarkera. Kako bi se krenulo prema razvoju kliničke analize temeljene na MS-u, budući smjer također zahtijeva korištenje ciljanih kvantitativnih metoda za provjeru biomarkera velikih razmjera, kao što je selektivno ili paralelno praćenje reakcija (62). Nedavno smo koristili paralelno praćenje reakcija (63) kako bismo potvrdili mnoge promjene proteina CSF-a koje su ovdje opisane. Nekoliko prioritetnih ciljeva na ploči kvantificirano je sa značajnom točnošću, uključujući YWHAZ, ALDOA i SMOC1, koji se preslikavaju na naše ploče sinapse, metabolizma i upale (63). Neovisno prikupljanje podataka (DIA) i druge strategije temeljene na MS-u također mogu biti korisne za provjeru cilja. Bud et al. (64) Nedavno je pokazano da postoji značajno preklapanje između AD biomarkera identificiranih u našem skupu podataka o otkrivanju likvora i nezavisnog skupa podataka DIA-MS, koji se sastoji od gotovo 200 uzoraka likvora iz tri različite europske kohorte. Ove nedavne studije podržavaju potencijal naših panela da se transformiraju u pouzdanu detekciju temeljenu na MS-u. Tradicionalna detekcija temeljena na antitijelima i aptamerima također je važna za daljnji razvoj ključnih AD biomarkera. Zbog niske zastupljenosti likvora, teže je detektirati ove biomarkere koristeći MS metode visoke propusnosti. NEFL i NRGN dva su takva primjera malobrojnih biomarkera likvora, koji su preslikani na ploču u našoj sveobuhvatnoj analizi, ali se ne mogu pouzdano detektirati pomoću naše jedinstvene MS strategije. Strategije ciljanja temeljene na višestrukim antitijelima, kao što je PEA, mogu pospješiti kliničku transformaciju ovih markera.
Sve u svemu, ova studija pruža jedinstveni proteomički pristup za identifikaciju i verifikaciju biomarkera AD CSF na temelju različitih sustava. Optimiziranje ovih panela markera u dodatnim skupinama AD i MS platformama moglo bi se pokazati obećavajućim za unaprjeđenje stratifikacije i liječenja AD rizika. Studije koje procjenjuju longitudinalnu razinu ovih panela tijekom vremena također su ključne za određivanje koja kombinacija markera najbolje stratificira rizik od rane bolesti i promjene u težini bolesti.
Osim 3 uzorka kopirana CSF-om, svi uzorci CSF-a korišteni u ovoj studiji prikupljeni su pod pokroviteljstvom Emory ADRC-a ili blisko povezanih istraživačkih institucija. U ovim proteomskim studijama korištena su ukupno četiri seta Emory CSF uzoraka. Utvrđeno je da kohorta likvora sadrži uzorke 20 zdravih kontrolnih osoba i 20 bolesnika s AD-om. CSF kopija 1 uključuje uzorke 32 zdrave kontrole, 31 osobe s AsymAD i 33 osobe s AD. CSF kopija 2 sadrži 147 kontrola i 150 AD uzoraka. Kohorta 4 replikacije likvora s više bolesti uključivala je 18 kontrolnih, 17 AD, 19 ALS, 13 PD i 11 FTD uzoraka. Prema sporazumu koji je odobrio Institucionalni revizijski odbor Sveučilišta Emory, svi sudionici studije Emory dobili su informirani pristanak. Prema Smjernicama najbolje prakse Nacionalnog instituta za starenje za centre za Alzheimerovu bolest iz 2014. (https://alz.washington.edu/BiospecimenTaskForce.html), cerebrospinalna tekućina prikupljena je i pohranjena lumbalnom punkcijom. Kontrolni i pacijenti s AsymAD i AD primili su standardiziranu kognitivnu procjenu na Klinici za kognitivnu neurologiju Emory ili Goizueta ADRC. Njihovi uzorci cerebrospinalne tekućine testirani su pomoću INNO-BIA AlzBio3 Luminex za ELISA Aβ1-42, analizu ukupnog tau i p-tau (65). Vrijednosti ELISA-e koriste se kao potpora dijagnostičkoj klasifikaciji ispitanika na temelju utvrđenih graničnih kriterija AD biomarkera (66, 67). Osnovni demografski i dijagnostički podaci za druge dijagnoze likvora (FTD, ALS i PD) također se dobivaju od Emory ADRC ili pridruženih istraživačkih institucija. Sažetak metapodataka o slučaju za ove Emory CSF slučajeve može se pronaći u tablici S1A. Značajke švicarske kohorte replikacije likvora 3 već su objavljene (45).
CSF je pronašao uzorak. Kako bismo povećali dubinu našeg otkrića skupa podataka o likvoru, imunološka konzumacija proteina s visokim udjelom provedena je prije tripsinizacije. Ukratko, 130 μl likvora iz 40 pojedinačnih uzoraka likvora i jednak volumen (130 μl) High Select Top14 Abundance Protein Depletion Resin (Thermo Fisher Scientific, A36372) stavljeno je u kolonu za centrifugiranje (Thermo Fisher Scientific, A89868) na sobnoj temperatura Inkubirati). Nakon centrifuge od 15 minuta, centrifugirajte uzorak na 1000 g 2 minute. 3K ultracentrifugalni filterski uređaj (Millipore, UFC500396) korišten je za koncentriranje uzorka efluenta centrifugiranjem na 14,000 g tijekom 30 minuta. Razrijedite sve količine uzorka do 75 μl s fosfatnim puferiranim fiziološkim rastvorom. Koncentracija proteina određena je metodom bicinhoninske kiseline (BCA) prema protokolu proizvođača (Thermo Fisher Scientific). Imunodepletirana CSF (60 μl) iz svih 40 uzoraka digestirana je s lizil endopeptidazom (LysC) i tripsinom. Ukratko, uzorak je reduciran i alkiliran s 1,2 μl 0,5 M tris-2(-karboksietil)-fosfina i 3 μl 0,8 M kloroacetamida na 90°C tijekom 10 minuta, a zatim sonikiran u vodenoj kupelji 15 minuta. Uzorak je razrijeđen sa 193 μl 8 M urea pufera [8 M urea i 100 mM NaHPO4 (pH 8,5)] do konačne koncentracije od 6 M uree. LysC (4,5 μg; Wako) koristi se za digestiju preko noći na sobnoj temperaturi. Uzorak je zatim razrijeđen do 1 M uree s 50 mM amonijevog bikarbonata (ABC) (68). Dodajte jednaku količinu (4,5 μg) tripsina (Promega), a zatim inkubirajte uzorak 12 sati. Zakiselite otopinu digestiranog peptida do konačne koncentracije od 1% mravlje kiseline (FA) i 0,1% trifluoroctene kiseline (TFA) (66), a zatim odsolite s 50 mg Sep-Pak C18 kolonom (Waters) kako je gore opisano (25) . Peptid je zatim eluiran u 1 ml 50% acetonitrila (ACN). Kako bi se standardizirala kvantifikacija proteina u serijama (25), alikvoti od 100 μl iz svih 40 uzoraka likvora kombinirani su kako bi se dobio miješani uzorak, koji je zatim podijeljen u pet uzoraka globalnog internog standarda (GIS) (48). Svi pojedinačni uzorci i kombinirani standardi suše se vakuumom velike brzine (Labconco).
CSF kopira uzorak. Dayon i kolege su prethodno opisali slabljenje imunološkog sustava i probavu CSF kopije 3 uzoraka (45, 46). Preostali replikatni uzorci nisu bili pojedinačno imunodepletirani. Probavite ove neuklonjene uzorke u tripsinu kao što je prethodno opisano (17). Za svaku ponovljenu analizu, alikvoti od 120 μl eluiranog peptida iz svakog uzorka skupljeni su zajedno i podijeljeni u alikvote jednakog volumena koji će se koristiti kao globalni interni standard označen TMT-om (48). Svi pojedinačni uzorci i kombinirani standardi suše se vakuumom velike brzine (Labconco). Kako bi se pojačao signal likvorskog proteina niske zastupljenosti, kombiniranjem 125 μl iz svakog uzorka, pripremljen je "poboljšani" uzorak za svaku ponavljanu analizu [tj., biološki uzorak koji oponaša istraživački uzorak, ali je dostupna količina mnogo veći (37, 69)] spojeni u miješani uzorak likvora (17). Miješani uzorak je zatim imunološki uklonjen upotrebom 12 ml High Select Top14 Abundance Protein Removal Resin (Thermo Fisher Scientific, A36372), digestiran kako je gore opisano, i uključen u naknadno višestruko TMT označavanje.
Vrijeme objave: 27. kolovoza 2021