Hvala što ste posjetili Nature.com. Verzija preglednika koju koristite ima ograničenu podršku za CSS. Za najbolje iskustvo preporučujemo da koristite ažurirani preglednik (ili onemogućite način kompatibilnosti u Internet Exploreru). U međuvremenu, kako bismo osigurali kontinuiranu podršku, prikazat ćemo stranicu bez stilova i JavaScripta.
Termofili su mikroorganizmi koji se razvijaju na visokim temperaturama. Njihovo proučavanje može pružiti vrijedne informacije o tome kako se život prilagođava ekstremnim uvjetima. Međutim, teško je postići uvjete visoke temperature s konvencionalnim optičkim mikroskopima. Predloženo je nekoliko domaćih rješenja koja se temelje na lokalnom otpornom električnom grijanju, ali ne postoji jednostavno komercijalno rješenje. U ovom radu predstavljamo koncept laserskog zagrijavanja mikroskopa preko vidnog polja mikroskopa kako bismo osigurali visoke temperature za studije termofila, a da pritom korisnikovo okruženje bude blago. Zagrijavanje na mikroskali pri umjerenom intenzitetu lasera može se postići korištenjem supstrata obloženog zlatnim nanočesticama kao biokompatibilnog i učinkovitog apsorbera svjetlosti. Raspravljaju se mogući učinci konvekcije tekućine na mikroskalama, zadržavanja stanica i centrifugalnog termoforetskog gibanja. Metoda je dokazana u dvije vrste: (i) Geobacillus stearothermophilus, aktivna termofilna bakterija koja se razmnožava na oko 65°C, za koju smo primijetili da klija, raste i pliva pod mikroskalnim zagrijavanjem; (ii) Thiobacillus sp., optimalno hipertermofilna arheja. na 80°C. Ovaj rad utire put jednostavnom i sigurnom promatranju termofilnih mikroorganizama korištenjem modernih i pristupačnih mikroskopskih alata.
Tijekom milijardi godina, život na Zemlji je evoluirao kako bi se prilagodio širokom rasponu okolišnih uvjeta koji se ponekad smatraju ekstremnim iz naše ljudske perspektive. Konkretno, neki termofilni mikroorganizmi (bakterije, arheje, gljive) koji se nazivaju termofili uspijevaju u temperaturnom rasponu od 45°C do 122°C1, 2, 3, 4. Termofili žive u različitim ekosustavima, kao što su duboki morski hidrotermalni izvori, topli izvori ili vulkanskim područjima. Njihovo istraživanje izazvalo je veliko zanimanje u posljednjih nekoliko desetljeća iz najmanje dva razloga. Prvo, od njih možemo naučiti, na primjer, kako su termofili 5, 6, enzimi 7, 8 i membrane 9 stabilni na tako visokim temperaturama ili kako termofili mogu izdržati ekstremne razine zračenja10. Drugo, oni su osnova za mnoge važne biotehnološke primjene1,11,12 kao što su proizvodnja goriva13,14,15,16, kemijska sinteza (dihidro, alkoholi, metan, aminokiseline, itd.)17, biorudarenje18 i termostabilni biokatalizatori7,11, 13. Konkretno, trenutno dobro poznata lančana reakcija polimeraze (PCR)19 uključuje enzim (Taq polimeraza) izoliran iz termofilne bakterije Thermus aquaticus, jedne od prvih otkrivenih termofila.
Međutim, proučavanje termofila nije lak zadatak i ne može se improvizirati ni u jednom biološkom laboratoriju. Konkretno, živi termofili se ne mogu promatrati in vitro s bilo kojim standardnim svjetlosnim mikroskopom, čak ni s komercijalno dostupnim komorama za grijanje, obično predviđenim za niske temperature od čak 40°C. Od 1990-ih samo se nekoliko istraživačkih grupa posvetilo uvođenju sustava visokotemperaturne mikroskopije (HTM). Godine 1994. Glukh i sur. Komora za grijanje/hlađenje zamišljena je na temelju upotrebe Peltierove ćelije koja kontrolira temperaturu pravokutnih kapilara zatvorenih radi održavanja anaerobnosti 20 . Uređaj se može zagrijati do 100 °C brzinom od 2 °C/s, što autorima omogućuje proučavanje pokretljivosti hipertermofilne bakterije Thermotoga maritima21. Godine 1999. Horn i sur. Razvijen je vrlo sličan uređaj, koji se još uvijek temelji na korištenju grijanih kapilara pogodan za komercijalnu mikroskopiju za proučavanje stanične diobe/veze. Nakon dugog razdoblja relativne neaktivnosti, potraga za učinkovitim HTM-ovima nastavljena je 2012., posebno u vezi sa nizom radova grupe Wirth koji su koristili uređaj koji su izumili Horn i sur. Prije petnaest godina, pokretljivost velikog broja arheja, uključujući hipertermofile, proučavana je na temperaturama do 100°C pomoću zagrijanih kapilara23,24. Također su modificirali originalni mikroskop kako bi se postiglo brže zagrijavanje (nekoliko minuta umjesto 35 minuta da se postigne postavljena temperatura) i postigao linearni temperaturni gradijent od više od 2 cm preko medija. Ovaj uređaj za oblikovanje temperaturnog gradijenta (TGFD) korišten je za proučavanje mobilnosti mnogih termofila unutar temperaturnih gradijenata na biološki relevantnim udaljenostima 24, 25 .
Zagrijavanje zatvorenih kapilara nije jedini način promatranja živih termofila. Godine 2012. Kuwabara i sur. Korištene su domaće Pyrex komore za jednokratnu upotrebu zapečaćene ljepilom otpornim na toplinu (Super X2; Cemedine, Japan). Uzorci su stavljeni na komercijalno dostupnu prozirnu grijaću ploču (Micro Heat Plate, Kitazato Corporation, Japan) koja se može zagrijati do 110°C, ali izvorno nije namijenjena za bioimaging. Autori su promatrali učinkovitu diobu anaerobnih termofilnih bakterija (Thermosipho globiformans, vrijeme udvostručenja 24 min) na 65°C. Godine 2020. Pulshen i sur. Učinkovito zagrijavanje komercijalnih metalnih posuda (AttofluorTM, Thermofisher) demonstrirano je pomoću dva domaća grijaća elementa: poklopca i postolja (konfiguracija inspirirana PCR strojem). Ova povezanost rezultira ujednačenom temperaturom tekućine i sprječava isparavanje i kondenzaciju na dnu poklopca. Upotrebom O-prstena izbjegava se izmjena plinova s okolinom. Ovaj HTM, nazvan Sulfoskop, korišten je za snimanje Sulfolobus acidocaldarius na 75°C27.
Priznato ograničenje svih ovih sustava bilo je ograničenje upotrebe zračnih objektiva, svako uranjanje u ulje nije prikladno za tako visoku temperaturu i za snimanje kroz prozirne uzorke debljine >1 mm. Priznato ograničenje svih ovih sustava bilo je ograničenje upotrebe zračnih objektiva, svako uranjanje u ulje nije prikladno za tako visoku temperaturu i za snimanje kroz prozirne uzorke debljine >1 mm. Općepoznati nedostatak svih ovih sustava bio je ograničen na korištenje zračnih objektiva, budući da svako uranjanje u ulje nije pristupilo tako visokoj temperaturi i za vizualizaciju kroz prozirne uzorke debljine > 1 mm. Prepoznati nedostatak svih ovih sustava bilo je ograničenje upotrebe zračnih objektiva, budući da uranjanje u ulje nije bilo prikladno za tako visoke temperature i za vizualizaciju kroz prozirne uzorke debljine > 1 mm.所有这些系统的一个公认限制是限制使用空气物镜，任何油浸都不适合这样的高温和通过> 1毫米厚的透明样品成像。 Priznato ograničenje svih ovih sustava je ograničenje upotrebe zrcala sa zrakom, budući da je uranjanje u ulje neprikladno za snimanje prozirnih uzoraka debljine >1 mm na tako visokim temperaturama. Općepoznati nedostatak svih ovih sustava je ograničeno korištenje zračnih objektiva, svako uranjanje u ulje neprimjereno za tako visoke temperature i vizualizacija kroz prozirne uzorke debljine >1 mm. Prepoznati nedostatak svih ovih sustava je ograničena upotreba zračnih leća, svako uranjanje u ulje je neprikladno za tako visoke temperature i vizualizaciju kroz prozirne uzorke debljine >1 mm.Nedavno su ovo ograničenje ukinuli Charles-Orzag et al. 28, koji je razvio uređaj koji više ne daje toplinu oko sustava od interesa, već unutar samog pokrovnog stakla, prekrivenog tankim prozirnim slojem otpornika napravljenog od ITO (indij-kositar oksid). Poklopac se može zagrijati do 75 °C propuštanjem električne struje kroz prozirni sloj. No, autor također mora zagrijati leću na objektiv, ali ne više od 65 °C, kako je ne bi oštetio.
Ovi radovi pokazuju da razvoj učinkovite visokotemperaturne optičke mikroskopije nije široko prihvaćen, često zahtijeva domaću opremu i često se postiže po cijenu prostorne rezolucije, što je ozbiljan nedostatak s obzirom na to da termofilni mikroorganizmi nisu veći od nekoliko mikrometara. Smanjeni volumen grijanja ključ je za rješavanje tri inherentna problema HTM-a: slaba prostorna rezolucija, visoka toplinska inercija kada se sustav zagrijava i štetno zagrijavanje okolnih elemenata (imerzijsko ulje, leća objektiva… ili ruke korisnika) na ekstremnim temperaturama. ).
U ovom radu uvodimo HTM za promatranje termofila koji se ne temelji na rezistivnom zagrijavanju. Umjesto toga, postigli smo lokalizirano zagrijavanje unutar ograničenog područja vidnog polja mikroskopa laserskim zračenjem supstrata koji upija svjetlost. Raspodjela temperature vizualizirana je pomoću kvantitativne fazne mikroskopije (QPM). Učinkovitost ove metode dokazuju Geobacillus stearothermophilus, pokretna termofilna bakterija koja se razmnožava na oko 65°C i ima kratko vrijeme udvostručenja (oko 20 minuta) i Sulfolobus shibatae, hipertermofil koji optimalno raste na 80°C (arheje) ilustrirati. Normalna brzina replikacije i plivanje promatrani su kao funkcija temperature. Ovaj laserski HTM (LA-HTM) nije ograničen debljinom pokrovnog stakalca ili prirodom objektiva (uronjenost u zrak ili ulje). To omogućuje korištenje bilo kojeg objektiva visoke rezolucije na tržištu. Također ne pati od sporog zagrijavanja zbog toplinske inercije (postiže trenutačno zagrijavanje na skali milisekunde) i koristi samo komercijalno dostupne komponente. Jedini novi sigurnosni problemi povezani su s prisutnošću snažnih laserskih zraka (obično do 100 mW) unutar uređaja i moguće kroz oči, za što su potrebne zaštitne naočale.
Načelo LA-HTM je korištenje lasera za lokalno zagrijavanje uzorka unutar vidnog polja mikroskopa (slika 1a). Da biste to učinili, uzorak mora upijati svjetlost. Kako bismo koristili razumnu snagu lasera (manju od 100 mW), nismo se oslanjali na apsorpciju svjetlosti od strane tekućeg medija, već smo umjetno povećali apsorpciju uzorka oblaganjem supstrata nanočesticama zlata (slika 1c). Zagrijavanje nanočestica zlata svjetlom od temeljne je važnosti za područje toplinske plazmonike, s očekivanim primjenama u biomedicini, nanokemiji ili sakupljanju sunčeve svjetlosti29,30,31. Tijekom proteklih nekoliko godina koristili smo ovaj LA-HTM u nekoliko studija povezanih s primjenom toplinske plazme u fizici, kemiji i biologiji. Glavna poteškoća s ovom metodom je u prikazivanju konačnog profila temperature, budući da je povišena temperatura ograničena na područje mikroskale unutar uzorka. Pokazali smo da se temperaturno mapiranje može postići interferometrom transverzalnog smicanja s četiri valne duljine, jednostavnom metodom visoke razlučivosti i vrlo osjetljivom metodom kvantitativne fazne mikroskopije koja se temelji na upotrebi dvodimenzionalnih difrakcijskih rešetki (također poznatih kao križne rešetke) 33,34,35,36. Pouzdanost ove tehnike toplinske mikroskopije, temeljene na mikroskopiji valnog fronta s križnom rešetkom (CGM), demonstrirana je u desetak radova objavljenih u proteklom desetljeću37,38,39,40,41,42,43.
Shema instalacije paralelnog laserskog zagrijavanja, oblikovanja i temperaturnog mikroskopa. b Geometrija uzorka koja se sastoji od AttofluorTM komore koja sadrži pokrovno stakalce obloženo nanočesticama zlata. c Pažljivo pogledajte uzorak (ne u mjerilu). d predstavlja uniformni profil laserske zrake i (e) simuliranu naknadnu raspodjelu temperature na ravnini uzorka nanočestica zlata. f je prstenasti profil laserske zrake prikladan za generiranje jednolike temperature kao što je prikazano u simulaciji rezultirajuće raspodjele temperature prikazane u (g). Mjerna traka: 30 µm.
Konkretno, nedavno smo postigli zagrijavanje stanica sisavaca s LA-HTM i CGM i pratili stanične reakcije toplinskog šoka u rasponu od 37-42°C, demonstrirajući primjenjivost ove tehnike za snimanje pojedinačnih živih stanica. Međutim, primjena LA-HTM za proučavanje mikroorganizama na visokim temperaturama nije nedvosmislena, jer zahtijeva više opreza u usporedbi sa stanicama sisavaca: prvo, zagrijavanje dna medija za desetke stupnjeva (a ne za nekoliko stupnjeva) dovodi do na jak vertikalni gradijent temperature. može stvoriti konvekciju tekućine 44 koja, ako nije čvrsto pričvršćena za podlogu, može uzrokovati neželjeno kretanje i miješanje bakterija. Ova se konvekcija može eliminirati smanjenjem debljine sloja tekućine. U tu svrhu, u svim dolje prikazanim eksperimentima, bakterijske suspenzije su stavljene između dva pokrovna stakalca debljine približno 15 µm unutar metalne čaše (AttofluorTM, Thermofisher, slika 1b,c). U principu, konvekcija se može izbjeći ako je debljina tekućine manja od veličine snopa grijaćeg lasera. Drugo, rad u tako ograničenoj geometriji može ugušiti aerobne organizme (vidi sliku S2). Ovaj se problem može izbjeći korištenjem podloge koja je propusna za kisik (ili bilo koji drugi vitalni plin), ostavljanjem zarobljenih mjehurića zraka unutar pokrovnog stakalca ili bušenjem rupa u gornjem pokrovnom stakalcu (vidi sliku S1) 45 . U ovoj studiji odabrali smo potonje rješenje (slike 1b i S1). Konačno, lasersko grijanje ne osigurava ravnomjernu raspodjelu temperature. Čak i pri istom intenzitetu laserske zrake (slika 1d), raspodjela temperature nije ravnomjerna, već nalikuje Gaussovoj raspodjeli zbog toplinske difuzije (slika 1e). Kada je cilj uspostaviti precizne temperature u vidnom polju za proučavanje bioloških sustava, neravni profili nisu idealni i također mogu dovesti do termoforetskog kretanja bakterija ako ne prianjaju na podlogu (vidi sl. S3, S4)39. U tu smo svrhu upotrijebili modulator prostorne svjetlosti (SLM) za oblikovanje infracrvene laserske zrake prema obliku prstena (slika 1f) u ravnini uzorka kako bismo postigli savršeno jednoliku temperaturnu raspodjelu unutar zadanog geometrijskog područja, unatoč toplinskoj difuziji (Slika 1d) 39, 42, 46. Stavite gornje pokrovno stakalce na metalnu posudu (Slika 1b) kako biste izbjegli isparavanje medija i promatrajte najmanje nekoliko dana. Budući da ovo gornje pokrovno stakalce nije zapečaćeno, dodatni medij se može jednostavno dodati u bilo kojem trenutku ako je potrebno.
Kako bismo ilustrirali kako LA-HTM radi i pokazali njegovu primjenjivost u termofilnim istraživanjima, proučavali smo aerobne bakterije Geobacillus stearothermophilus, čija je optimalna temperatura rasta oko 60-65°C. Bakterija također ima flagele i sposobnost plivanja, što je još jedan pokazatelj normalne stanične aktivnosti.
Uzorci (slika 1b) prethodno su inkubirani na 60°C jedan sat i zatim stavljeni u LA-HTM držač uzoraka. Ova predinkubacija nije obvezna, ali je ipak korisna iz dva razloga: Prvo, kada je laser uključen, uzrokuje trenutni rast i diobu stanica (pogledajte film M1 u Dodatnim materijalima). Bez predinkubacije, rast bakterija obično se odgađa za oko 40 minuta svaki put kada se na uzorku zagrije novo područje za promatranje. Drugo, jednosatna predinkubacija pospješila je prianjanje bakterija na pokrovno stakalce, sprječavajući da stanice ispadnu iz vidnog polja zbog termoforeze kada je laser bio uključen (vidi film M2 u Dodatnim materijalima). Termoforeza je kretanje čestica ili molekula duž temperaturnog gradijenta, obično od vrućeg do hladnog, a bakterije nisu iznimka43,47. Taj se neželjeni učinak eliminira na određenom području korištenjem SLM-a za oblikovanje laserske zrake i postizanje ravne raspodjele temperature.
Na sl. Slika 2 prikazuje raspodjelu temperature izmjerenu CGM-om dobivenu ozračivanjem staklene podloge obložene nanočesticama zlata prstenastom laserskom zrakom (slika 1f). Uočena je ravna raspodjela temperature na cijelom području pokrivenom laserskom zrakom. Ova zona je postavljena na 65°C, optimalnu temperaturu rasta. Izvan ovog područja temperaturna krivulja prirodno pada na \(1/r\) (gdje je \(r\) radijalna koordinata).
Temperaturna mapa CGM mjerenja dobivena korištenjem prstenaste laserske zrake za ozračivanje sloja nanočestica zlata kako bi se dobio ravni temperaturni profil na kružnom području. b Izoterma temperaturne karte (a). Kontura laserske zrake predstavljena je sivim točkastim krugom. Eksperiment je ponovljen dva puta (vidi dopunske materijale, slika S4).
Viabilnost bakterijskih stanica praćena je nekoliko sati pomoću LA-HTM. Na sl. Slika 3 prikazuje vremenski interval za četiri slike snimljene iz filma od 3 sata i 20 minuta (film M3, dodatne informacije). Uočeno je da se bakterije aktivno razmnožavaju unutar kružnog područja definiranog laserom gdje je temperatura bila optimalna, približavajući se 65°C. Nasuprot tome, rast stanica je značajno smanjen kada je temperatura pala ispod 50°C tijekom 10 sekundi.
Optičke dubinske slike bakterije G. stearothermophilus koja raste nakon laserskog zagrijavanja u različitim vremenima, (a) t = 0 min, (b) 1 h 10 min, (c) 2 h 20 min, (d) 3 h 20 min, izvan 200 Izvađeno iz jednominutnog filma (M3 film dat u Dodatnim informacijama) superponiranog na odgovarajuću temperaturnu kartu. Laser se uključuje u trenutku \(t=0\). Izoterme su dodane slici intenziteta.
Kako bismo dodatno kvantificirali rast stanica i njegovu ovisnost o temperaturi, izmjerili smo povećanje biomase različitih kolonija inicijalno izoliranih bakterija u vidnom polju Movie M3 (slika 4). Roditeljske bakterije odabrane na početku formiranja mini kolonija (mCFU) prikazane su na slici S6. Mjerenja suhe mase obavljena su kamerom CGM 48 koja je korištena za mapiranje raspodjele temperature. Sposobnost CGM-a da mjeri suhu težinu i temperaturu je snaga LA-HTM-a. Očekivano, visoka temperatura uzrokovala je brži rast bakterija (Sl. 4a). Kao što je prikazano na polulogaritamskom dijagramu na slici 4b, rast na svim temperaturama slijedi eksponencijalni rast, gdje podaci koriste eksponencijalnu funkciju \(m={m}_{0}{10}^{t/\ tau }+ {{ \mbox{cst}}}\), gdje \(\tau {{{{{\rm{log }}}}}}2\) – vrijeme generiranja (ili vrijeme udvostručenja), \( g =1/ \tau\) – brzina rasta (broj dijeljenja u jedinici vremena). Na sl. Slika 4c prikazuje odnosnu brzinu rasta i vrijeme stvaranja kao funkciju temperature. Brzo rastuće mCFU karakterizira zasićenje rasta nakon dva sata, što je očekivano ponašanje zbog visoke gustoće bakterija (slično stacionarnoj fazi u klasičnim tekućim kulturama). Opći oblik \(g\lijevo(T\desno)\) (Sl. 4c) odgovara očekivanoj dvofaznoj krivulji za G. stearothermophilus s optimalnom stopom rasta oko 60-65°C. Usporedite podatke koristeći kardinalni model (Slika S5)49 gdje \(\left({{G}_{0}{;\;T}}_{{\min }};{T}_{{opt} } ;{T}_{{\max}}\right)\) = (0,70 ± 0,2; 40 ± 4; 65 ± 1,6; 67 ± 3) °C, što se dobro slaže s drugim vrijednostima navedenim u literaturi49. Iako se parametri ovisni o temperaturi mogu reproducirati, maksimalna stopa rasta \({G}_{0}\) može varirati od jednog eksperimenta do drugog (vidi slike S7-S9 i film M4). Za razliku od parametara prilagodbe temperature, koji bi trebali biti univerzalni, maksimalna stopa rasta ovisi o svojstvima medija (dostupnost hranjivih tvari, koncentracija kisika) unutar promatrane geometrije mikroskale.
a Mikrobni rast na različitim temperaturama. mCFU: Minijaturne jedinice za stvaranje kolonija. Podaci dobiveni iz videa jedne bakterije koja raste u temperaturnom gradijentu (film M3). b Isto kao (a), polulogaritamska ljestvica. c Brzina rasta\(\tau\) i vrijeme generacije\(g\) izračunati iz linearne regresije (b). Horizontalne trake pogrešaka: temperaturni raspon preko kojeg su se mCFU proširili u vidno polje tijekom rasta. Vertikalne trake pogrešaka: standardna pogreška linearne regresije.
Osim normalnog rasta, neke su bakterije ponekad isplivale u vidokrug tijekom laserskog zagrijavanja, što je očekivano ponašanje za bakterije s flagelama. Film M5 u dodatnim informacijama prikazuje takve plivačke aktivnosti. U ovom eksperimentu, ujednačeno lasersko zračenje korišteno je za stvaranje temperaturnog gradijenta, kao što je prikazano na slikama 1d, e i S3. Slika 5 prikazuje dvije sekvence slika odabrane iz filma M5 koje pokazuju da jedna bakterija pokazuje usmjereno kretanje dok sve druge bakterije ostaju nepomične.
Dva vremenska okvira (a) i (b) pokazuju plivanje dviju različitih bakterija označenih točkastim krugovima. Slike su izvučene iz filma M5 (priložen kao dodatni materijal).
U slučaju G. stearothermophilus, aktivno kretanje bakterija (slika 5) počelo je nekoliko sekundi nakon uključivanja laserske zrake. Ovo opažanje naglašava vremenski odgovor ovog termofilnog mikroorganizma na povećanje temperature, kao što su već uočili Mora i sur. 24 . Tema bakterijske pokretljivosti, pa čak i termotaksije, može se dalje istraživati pomoću LA-HTM.
Mikrobno plivanje ne treba brkati s drugim vrstama fizičkog kretanja, naime (i) Brownovim gibanjem, koje se čini kaotičnim kretanjem bez određenog smjera, (ii) konvekcijom 50 i termoforezom 43, koja se sastoji od pravilnog pomicanja kretanja duž temperature gradijent.
G. stearothermophilus poznat je po svojoj sposobnosti stvaranja vrlo otpornih spora (stvaranje spora) kada je izložen nepovoljnim uvjetima okoline kao obrana. Kada uvjeti okoliša ponovno postanu povoljni, spore klijaju, tvore žive stanice i nastavljaju rast. Iako je ovaj proces sporulacije/klijanja dobro poznat, nikada nije promatran u stvarnom vremenu. Koristeći LA-HTM, ovdje izvještavamo o prvom opažanju događaja klijanja kod G. stearothermophilus.
Na sl. Slika 6a prikazuje slike optičke dubine (OT) dobivene pomoću CGM skupa od 13 spora. Za cijelo vrijeme sakupljanja (15 h 6 min, \(t=0\) – početak laserskog zagrijavanja), 4 od 13 spora su proklijale, u uzastopnim vremenskim točkama \(t=2\) h, \( 3\ ) h \(10 \)', \(9\) h \(40\)' i \(11\) h \(30\)'. Iako je samo jedan od ovih događaja prikazan na slici 6, 4 događaja klijanja mogu se promatrati u M6 filmu u dodatnom materijalu. Zanimljivo je da se čini da je klijanje nasumično: sve spore ne klijaju i ne klijaju u isto vrijeme, unatoč istim promjenama u okolišnim uvjetima.
Time-lapse koji se sastoji od 8 OT slika (uljna imerzija, 60x, 1,25 NA objektiv) i (b) evolucija biomase agregata G. stearothermophilus. c (b) Nacrtano na polulogaritamskoj ljestvici kako bi se istaknula linearnost stope rasta (isprekidana linija).
Na sl. Slika 6b,c prikazuje biomasu staničnih populacija u vidnom polju kao funkciju vremena tijekom cijelog razdoblja prikupljanja podataka. Brzo raspadanje suhe mase promatrano pri \(t=5\)h na sl. 6b, c, zbog izlaska nekih stanica iz vidnog polja. Brzina rasta ova četiri događaja je \(0,77\pm 0,1\) h-1. Ova vrijednost je viša od stope rasta povezane sa slikom 3. 3 i 4, gdje stanice rastu normalno. Razlog povećane stope rasta G. stearothermophilus iz spora nije jasan, ali ova mjerenja naglašavaju interes LA-HTM-a i rada na razini jedne stanice (ili na razini jedne mCFU) kako bi se saznalo više o dinamici života stanice. .
Kako bismo dodatno pokazali svestranost LA-HTM-a i njegovu učinkovitost na visokim temperaturama, ispitali smo rast Sulfolobus shibatae, hipertermofilne acidofilne arheje s optimalnom temperaturom rasta od 80°C51. U usporedbi s G. stearothermophilus, ove arheje također imaju vrlo drugačiju morfologiju, više nalikuju kuglicama od 1 mikrona (koke) nego izduženim štapićima (bacili).
Slika 7a sastoji se od sekvencijalnih optičkih dubinskih slika S. shibatae mCFU dobivenih korištenjem CGM (pogledajte igrani film M7 u Dodatnim materijalima). Ovaj mCFU raste na oko 73°C, ispod optimalne temperature od 80°C, ali unutar temperaturnog raspona za aktivni rast. Promatrali smo višestruke događaje fisije koji su nakon nekoliko sati učinili da mCFU izgledaju poput mikrogrožđa arheja. Iz ovih OT slika, mCFU biomasa je mjerena tijekom vremena i prikazana na slici 7b. Zanimljivo je da su mCFU-i S. shibatae pokazali linearni rast, a ne eksponencijalni rast uočen s mCFU-ima G. stearothermophilus. Dugo se raspravlja 52 o prirodi stopa rasta stanica: dok neke studije izvješćuju o stopama rasta mikroba koje su proporcionalne njihovoj veličini (eksponencijalni rast), druge pokazuju konstantnu stopu (linearni ili bilinearni rast). Kao što su objasnili Tzur i sur.53, razlikovanje eksponencijalnog i (bi)linearnog rasta zahtijeva preciznost od <6% u mjerenjima biomase, što je nedostižno za većinu QPM tehnika, čak i uključujući interferometriju. Kao što su objasnili Tzur i sur.53, razlikovanje eksponencijalnog i (bi)linearnog rasta zahtijeva preciznost od <6% u mjerenjima biomase, što je nedostižno za većinu QPM tehnika, čak i uključujući interferometriju. Kako su objasnili Cur i dr.53, različiti eksponencijalni i (bi)linearni rast zahtijevaju točnost <6% u mjerenju biomase, što je nedostatno za većinu metoda QPM, čak i uz korištenje interferometrije. Kao što su objasnili Zur i sur.53, razlikovanje eksponencijalnog i (bi)linearnog rasta zahtijeva <6% točnosti u mjerenjima biomase, što je nedostižno za većinu QPM metoda, čak i korištenjem interferometrije.Kao što su objasnili Zur i sur. 53, razlikovanje eksponencijalnog i (bi)linearnog rasta zahtijeva manje od 6% točnosti u mjerenjima biomase, što je nedostižno za većinu QPM metoda, čak i kada se koristi interferometrija. CGM postiže ovu točnost s sub-pg točnošću u mjerenjima biomase36,48.
Time-lapse koji se sastoji od 6 OT slika (uljna imerzija, 60x, NA objektiv 1,25) i (b) mikro-CFU evolucija biomase mjerena CGM-om. Pogledajte film M7 za više informacija.
Savršeno linearni rast S. shibatae bio je neočekivan i još nije prijavljen. Međutim, očekuje se eksponencijalni rast, barem zato što s vremenom mora doći do višestrukih dioba od 2, 4, 8, 16… stanica. Pretpostavili smo da bi linearni rast mogao biti posljedica stanične inhibicije zbog gustog pakiranja stanica, baš kao što se rast stanice usporava i na kraju doseže stanje mirovanja kada je gustoća stanica previsoka.
Zaključujemo redom raspravljajući o sljedećih pet točaka interesa: smanjenje volumena zagrijavanja, smanjenje toplinske inercije, zanimanje za nanočestice zlata, zanimanje za kvantitativnu faznu mikroskopiju i mogući temperaturni raspon u kojem se LA-HTM može koristiti.
U usporedbi s otpornim grijanjem, lasersko grijanje koje se koristi za razvoj HTM-a nudi nekoliko prednosti, koje ilustriramo u ovoj studiji. Konkretno, u tekućim medijima u vidnom polju mikroskopa, volumen zagrijavanja održava se unutar nekoliko (10 μm) 3 volumena. Na taj su način samo promatrani mikrobi aktivni, dok su ostale bakterije u stanju mirovanja i mogu se koristiti za daljnje proučavanje uzorka – nema potrebe mijenjati uzorak svaki put kada treba provjeriti novu temperaturu. Osim toga, zagrijavanje na mikroskali omogućuje izravno ispitivanje velikog raspona temperatura: Slika 4c dobivena je iz 3-satnog filma (Film M3), koji obično zahtijeva pripremu i ispitivanje nekoliko uzoraka – po jedan za svaki uzorak koji se proučava. y je temperatura koja predstavlja broj dana u eksperimentu. Smanjenje grijanog volumena također održava sve okolne optičke komponente mikroskopa, posebno leću objektiva, na sobnoj temperaturi, što je do sada bio veliki problem s kojim se zajednica suočavala. LA-HTM se može koristiti s bilo kojom lećom, uključujući uljne imerzijske leće, i ostat će na sobnoj temperaturi čak i pri ekstremnim temperaturama u vidnom polju. Glavno ograničenje metode laserskog zagrijavanja koje navodimo u ovoj studiji je da stanice koje ne prianjaju ili lebde mogu biti daleko od vidnog polja i teško ih je proučavati. Zaobilazno rješenje moglo bi biti korištenje leća s malim povećanjem kako bi se postigao veći porast temperature veći od nekoliko stotina mikrona. Ovaj oprez prati smanjenje prostorne razlučivosti, ali ako je cilj proučavanje kretanja mikroorganizama, visoka prostorna razlučivost nije potrebna.
Vremenska skala za grijanje (i hlađenje) sustava \({{{{{\rm{\tau }}}}}}}}_{{{\mbox{D}}}}\) ovisi o njegovoj veličini, prema zakonu \({{{({\rm{\tau }}}}}}}_{{{\mbox{D}}}}={L}^{2}/D\), gdje \ (L\ ) je karakteristična veličina izvora topline (promjer laserske zrake u našem istraživanju je \(L\ oko 100\) μm), \(D\) je toplinska difuzivnost okoline (prosjek u našem slučaj, staklo i voda Brzina difuzije\(D\ oko 2\puta {10}^{-7}\) m2/s Stoga, u ovoj studiji, vremenski odzivi reda veličine 50 ms, tj. kvazi-trenutni). Ova trenutna uspostava porasta temperature ne samo da skraćuje trajanje eksperimenta, već također omogućuje precizno određivanje vremena \(t=0\) za bilo koje dinamičko proučavanje temperaturnih učinaka.
Predložena metoda primjenjiva je na bilo koju podlogu koja apsorbira svjetlost (na primjer, komercijalni uzorci s ITO premazom). Međutim, nanočestice zlata mogu pružiti visoku apsorpciju u infracrvenom području i nisku apsorpciju u vidljivom rasponu, čije su posljednje karakteristike od interesa za učinkovito optičko promatranje u vidljivom rasponu, posebno kada se koristi fluorescencija. Osim toga, zlato je biokompatibilno, kemijski inertno, optička gustoća se može podešavati od 530 nm do bliske infracrvene, a priprema uzorka je jednostavna i ekonomična29.
Mikroskopija valne fronte s poprečnom rešetkom (CGM) omogućuje ne samo mapiranje temperature na mikroskali, već i praćenje biomase, što je čini osobito korisnom (ako ne i nužnom) u kombinaciji s LA-HTM. Tijekom prošlog desetljeća razvijene su druge tehnike temperaturne mikroskopije, posebno u području bioimaginga, a većina njih zahtijeva upotrebu temperaturno osjetljivih fluorescentnih sondi54,55. Međutim, te su metode kritizirane i neka su izvješća mjerila nerealne promjene temperature unutar stanica, vjerojatno zbog činjenice da fluorescencija ovisi o mnogim čimbenicima osim temperature. Osim toga, većina fluorescentnih sondi je nestabilna na visokim temperaturama. Stoga QPM, a posebice CGM predstavljaju idealnu tehniku temperaturne mikroskopije za proučavanje života na visokim temperaturama pomoću optičke mikroskopije.
Studije S. shibatae, koje optimalno žive na 80°C, pokazuju da se LA-HTM može primijeniti za proučavanje hipertermofila, a ne samo jednostavnih termofila. U načelu, ne postoji ograničenje raspona temperatura koje se mogu postići pomoću LA-HTM, a čak se i temperature iznad 100°C mogu postići pri atmosferskom tlaku bez vrenja, kao što je pokazala naša grupa od 38 u primjenama hidrotermalne kemije pri atmosferskom tlak A. Laser se koristi za zagrijavanje nanočestica zlata 40 na isti način. Dakle, LA-HTM ima potencijal da se koristi za promatranje neviđenih hipertermofila sa standardnom optičkom mikroskopijom visoke rezolucije u standardnim uvjetima (tj. pod stresom okoliša).
Svi eksperimenti su izvedeni korištenjem domaćeg mikroskopa, uključujući Köhlerovo osvjetljenje (s LED, M625L3, Thorlabs, 700 mW), držač uzoraka s ručnim xy pomicanjem, objektive (Olympus, 60x, 0,7 NA, zrak, LUCPlanFLN60X ili 60x, 1,25 NA, ulje , UPLFLN60XOI), CGM kamera (QLSI križna rešetka, korak od 39 µm, 0,87 mm od senzora kamere Andor Zyla) za pružanje slike intenziteta i valne fronte, i sCMOS kamera (ORCA Flash 4.0 V3, 16-bitni način rada, iz Hamamatsua) za snimanje podaci prikazani na slici 5 (bakterijsko plivanje). Dikroični razdjelnik snopa je BrightLine edge od 749 nm (Semrock, FF749-SDi01). Filtar na prednjoj strani fotoaparata je 694 kratkopropusni filtar (FF02-694/SP-25, Semrock). Titan safirni laser (Laser Verdi G10, 532 nm, 10 W, pumpana tsunami laserska šupljina, Spectra-Physics na sl. 2-5, dalje zamijenjen Millenia laserom, Spectraphysics 10 W, pumpana laserska šupljina Mira, Coherent, za sl. 2 -5). 6 i 7) postavljeni su na valnu duljinu \({{{({\rm{\lambda }}}}}}=800\) nm, što odgovara spektru plazmonske rezonancije nanočestica zlata. Modulatori prostornog svjetla (1920 × 1152 piksela) kupljeni su od holograma Gerchberg-Saxtona kao što je opisano u poveznici.
Cross grating wavefront microscopy (CGM) je tehnika optičke mikroskopije koja se temelji na kombinaciji dvodimenzionalne difrakcijske rešetke (također poznate kao križna rešetka) na udaljenosti od jednog milimetra od senzora konvencionalne kamere. Najčešći primjer CGM-a koji smo koristili u ovoj studiji zove se interferometar s poprečnim pomakom s četiri valne duljine (QLSI), gdje se križna rešetka sastoji od šahovnice intenzitet/faza koju su uveli i patentirali Primot et al. u 200034. Okomite i vodoravne rešetkaste linije stvaraju rešetkaste sjene na senzoru, čije se izobličenje može numerički obraditi u stvarnom vremenu kako bi se dobilo optičko izobličenje valne fronte (ili ekvivalentni fazni profil) upadne svjetlosti. Kada se koristi na mikroskopu, CGM kamera može prikazati razliku optičke putanje snimljenog objekta, poznatu i kao optička dubina (OT), s osjetljivošću reda veličine nanometara36. U svakom CGM mjerenju, kako bi se eliminirali bilo kakvi nedostaci u optičkim komponentama ili zrakama, mora se uzeti primarna referentna OT slika i oduzeti od svih sljedećih slika.
Temperaturna mikroskopija je izvedena pomoću CGM kamere kako je opisano u referenci. 32. Ukratko, zagrijavanje tekućine mijenja njezin indeks loma, stvarajući učinak toplinske leće koja iskrivljuje upadnu zraku. Ovo izobličenje valne fronte mjeri CGM i obrađuje pomoću algoritma dekonvolucije kako bi se dobila trodimenzionalna raspodjela temperature u tekućem mediju. Ako su nanočestice zlata ravnomjerno raspoređene po uzorku, mapiranje temperature može se napraviti u područjima bez bakterija kako bi se proizvele bolje slike, što ponekad radimo. Referentna CGM slika snimljena je bez zagrijavanja (s isključenim laserom) i zatim snimljena na istom mjestu na slici s uključenim laserom.
Mjerenje suhe mase postiže se istom CGM kamerom koja se koristi za snimanje temperature. CGM referentne slike dobivene su brzim pomicanjem uzorka po x i y tijekom izlaganja kao sredstvo za izračunavanje prosjeka bilo koje nehomogenosti u OT-u zbog prisutnosti bakterija. Iz OT slika bakterija, njihova je biomasa dobivena korištenjem skupa slika preko područja odabranih korištenjem Matlabovog domaćeg algoritma segmentacije (vidi pododjeljak “Numerički kod”), slijedeći postupak opisan u ref. 48. Ukratko, koristimo relaciju \(m={\alpha}^{-1}\iint {{\mbox{OT}}}\left(x,y\right){{\mbox{d}} } x{{\mbox{d}}}y\), gdje je \({{\mbox{OT}}}\left(x,y\right)\) slika optičke dubine, \(m\) je suha težina i \({{{{{\rm{\alpha }}}}}}\) je konstanta. Odabrali smo \({{{{\rm{\alpha))))))=0,18\) µm3/pg, što je tipična konstanta za žive stanice.
Pokrovno stakalce promjera 25 mm i debljine 150 µm obloženo nanočesticama zlata stavljeno je u komoru AttofluorTM (Thermofisher) s nanočesticama zlata okrenutim prema gore. Geobacillus stearothermophilus prethodno je uzgajan preko noći u LB mediju (200 okretaja u minuti, 60°C) prije svakog dana pokusa. Kap od 5 µl suspenzije G. stearothermophilus optičke gustoće (OD) od 0,3 do 0,5 stavljena je na pokrovno stakalce s nanočesticama zlata. Potom je na kap nakapano okruglo pokrovno stakalce promjera 18 mm s rupom promjera 5 mm u sredini, te je više puta na središte rupice naneseno 5 μl bakterijske suspenzije iste optičke gustoće. Jažice na pokrovnim stakalcima pripremljene su u skladu s postupkom opisanim u ref. 45 (pogledajte Dodatne informacije za više informacija). Zatim dodajte 1 ml LB medija na pokrovno stakalce kako biste spriječili isušivanje tekućeg sloja. Zadnje pokrovno stakalce stavlja se preko zatvorenog poklopca Attofluor™ komore kako bi se spriječilo isparavanje medija tijekom inkubacije. Za pokuse klijanja koristili smo spore, koje su nakon konvencionalnih pokusa ponekad prekrile vrh pokrovnog stakalca. Slična metoda korištena je za dobivanje Sulfolobus shibatae. Tri dana (200 okretaja u minuti, 75°C) preliminarne kultivacije Thiobacillus serrata provedena su u mediju 182 (DSMZ).
Uzorci nanočestica zlata pripremljeni su micelarnom blok kopolimer litografijom. Ovaj proces je detaljno opisan u Pogl. 60. Ukratko, micele koje inkapsuliraju ione zlata sintetizirane su miješanjem kopolimera s HAuCl4 u toluenu. Očišćena pokrovna stakalca zatim su uronjena u otopinu i tretirana UV zračenjem u prisutnosti redukcijskog sredstva kako bi se dobilo zlatno sjeme. Konačno, zlatno sjeme je uzgojeno dovođenjem u kontakt stakalca s vodenom otopinom KAuCl4 i etanolamina tijekom 16 minuta, što je rezultiralo kvaziperiodičnim i vrlo ujednačenim rasporedom nesferičnih nanočestica zlata u bliskom infracrvenom zračenju.
Kako bismo pretvorili interferograme u OT slike, koristili smo domaći algoritam, kao što je detaljno opisano na poveznici. 33 i dostupan je kao Matlab paket u sljedećem javnom repozitoriju: https://github.com/baffou/CGMprocess. Paket može izračunati intenzitet i OT slike na temelju snimljenih interferograma (uključujući referentne slike) i udaljenosti niza kamera.
Za izračunavanje faznog uzorka primijenjenog na SLM za dobivanje zadanog temperaturnog profila, upotrijebili smo prethodno razvijen domaći algoritam39,42 koji je dostupan u sljedećem javnom repozitoriju: https://github.com/baffou/SLM_temperatureShaping. Ulaz je polje željene temperature, koje se može postaviti digitalno ili putem monokromatske bmp slike.
Za segmentiranje stanica i mjerenje njihove suhe težine upotrijebili smo naš Matlab algoritam objavljen u sljedećem javnom repozitoriju: https://github.com/baffou/CGM_magicWandSegmentation. Na svakoj slici korisnik mora kliknuti na bakteriju ili mCFU od interesa, prilagoditi osjetljivost štapića i potvrditi odabir.
Za više informacija o dizajnu studije pogledajte sažetak Izvješća o istraživanju prirode povezan s ovim člankom.
Podaci koji podupiru rezultate ove studije dostupni su od dotičnih autora na razuman zahtjev.
Izvorni kod korišten u ovoj studiji detaljno je opisan u odjeljku Metode, a verzije za otklanjanje pogrešaka mogu se preuzeti s https://github.com/baffou/ u sljedećim spremištima: SLM_temperatureShaping, CGMprocess i CGM_magicWandSegmentation.
Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. & Sharma, AK Uvid u termofile i njihovu široku primjenu. Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. & Sharma, AK Uvid u termofile i njihovu široku primjenu.Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. i Sharma, AK Pregled termofila i njihove široke primjene. Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. i Sharma, AK 深入了解嗜热菌及其广谱应用。 Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. i Sharma, AK.Mehta R., Singhal P., Singh H., Damle D. i Sharma AK Duboko razumijevanje termofila i širok raspon primjena.3 Biotehnologija 6, 81 (2016).
Vrijeme objave: 26. rujna 2022